玉米贝壳杉烯合酶功能鉴定及kauralexins关键酶基因An2启动子分析

摘要

玉米(Zea mays L.)是重要粮食作物，但病虫害导致其产量和品质下降，威胁粮食安全。植保素是植物受病害真菌侵染产生的小分子次生代谢化合物。Kauralexins是玉米中首次发现的一种二萜植保素，具有良好的抗病原真菌活性，且对玉米螟幼虫有拒食作用。Kauralexin具有（异）贝壳杉烯骨架，其生物合成途径是由柯巴基焦磷酸合酶CPS和（异）贝壳杉烯合酶KS(L)连续催化前体GGPP形成贝壳杉烯或异贝壳杉烯，进一步由细胞色素P450氧化酶氧化修饰形成。参与kauralexin生物合成的CPS已经被鉴定为An2，但其贝壳杉烯合酶还未鉴定。另外植物激素赤霉素的生物合成也需要贝壳杉烯合酶的参与，有报道称玉米矮化突变体d5是由于贝壳杉烯合酶基因突变导致赤霉素合成受阻而产生的矮化，但相关基因还未被鉴定。并且到目前为止，还未有报道鉴定玉米贝壳杉烯合酶基因，这限制了玉米植保素kauralexin的相关研究及其应用。同时，植保素积累与其代谢关键基因表达密切相关，分析kauralexin代谢关键基因An2的启动子活性并鉴定其顺式元件，能为kauralexin的代谢调控研究奠定基础。
　　本研究首先在玉米全基因组中搜索贝壳杉烯合酶，并通过系统进化对其进行功能预测。其中ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1与禾本科植物的贝壳杉烯合酶具有较近的进化关系，即作为候选基因进行功能研究。通过大肠杆菌重组表达和代谢工程分析，并结合本氏烟瞬时表达，对产物进行GC-MS检测确定其生化功能，即催化ent-CPP形成贝壳杉烯。进一步通过亚细胞定位分析确认其功能。同时分析了这三个基因在病原菌侵染和激素处理下的表达模式，并结合玉米d5矮化突变体确定了这三个基因的生物学功能。另外，还利用基因枪瞬时表达体系，分析了An2基因启动子的活性区域。主要结果如下:
　　1.对从玉米基因组中搜索出的贝壳杉烯合酶基因，通过氨基酸序列比对，与其他禾本科植物的KS(L)s等进行系统进化分析，发现ZmKSL3与多种植物中参与赤霉素合成的KS的亲缘关系十分相近，而ZmKSL5与ZmTPS1除了本身相近之外，还与小麦中的TaKSL5-1/2相近，它们都不含有γ结构域。进一步分析发现ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1在玉米二号染色体上呈现串联排列，预示着这三个基因在进化上可能是串联复制而来。
　　2.在大肠杆菌重组表达这三个基因并通过代谢工程的方法与玉米中的ent-CPP合酶An2共表达，GC-MS检测产物发现ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1都能催化ent-CPP生成贝壳杉烯(ent-kaurene)。前人研究认为ZmTPS1为倍半萜合酶，本研究通过分析发现ZmTPS1确实具有一定的倍半萜合酶活性，能催化FPP产生一系列倍半萜，而ZmKSL3和ZmKSL5则不具有该功能。但进一步在本氏烟草中瞬时表达这三个基因，结果证明它们在植物体内也能产生贝壳杉烯。亚细胞定位分析显示，这三个蛋白都定位与质体中，符合其贝壳杉烯合酶的功能。因此结合生物化功能鉴定和亚细胞定位分析确定这三个基因均编码贝壳杉烯合酶。
　　3.对玉米d5突变体进行半定量PCR分析发现这三个基因中只有ZmKSL3在d5突变体中不表达，并且以往转录组数据显示其在生长旺盛的区域有高表达，表明ZmKSL3参与赤霉素生物合成。而对该突变体中ZmKSL3基因组序列分析，发现与其野生型母本和B73自交系中的序列相比，突变体中的ZmKSL3在5'-UTR部分起始密码子之前缺失了100bp的片段，其中包含与转录相关的CAAT元件，这可能就是引起其不表达的原因。而ZmTPS1或ZmKSL5的突变体均并未出现矮化的表现型，表明不参与赤霉素生物合成。前人研究发现d5突变体中仍然可检测到少量的贝壳杉烯，对d5突变体中ZmKSL5和ZmTPS1序列进行分析未发现明显突变，进一步进行体外生化功能分析发现这两个基因的d5克隆仍然具有贝壳杉烯合酶功能，但可能具有严格的调控机制使其不能对d5突变进行补偿。
　　4.利用荧光定量PCR，分析了ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1在不同处理下的表达情况，并与kauralexin代谢关键基因An2进行比较。研究表明，ZmKSL3在禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)孢子侵染的叶片和ABA处理的根部有少量诱导，这可能与其启动子中所含有的相关元件有关。而ZmKSL5和ZmTPS1在禾谷镰刀菌孢子侵染的叶片、ABA处理的地下部分、MeJA和ETH联合处理的叶片和MeJA单独处理的叶片中都明显上调，并且与An2在这四种处理中的表现呈现正相关。对玉米生长发育各时期的转录组数据分析发现ZmTPS1和ZmKSL5与An2之间也有相似的表达模式，而ZmKSL3则不同，这表明ZmTPS1与ZmKSL5参与植保素kauralexin的合成。
　　5.通过在线预测发现An2启动子中含有2个W-box，可能与其参与植保素kauralexin的诱导表达有关。利用基因枪轰击介导的瞬时转化体系，在玉米愈伤组织中进行了An2基因启动子活性的分析，结果发现，不含有第一个W-box元件的启动子片段A2F2与突变掉第一个W-box元件的A2F1M都无法检测的启动子活性，而含有第一个元件的A2F1则能检测到活性。这证明能够介导An2启动子的关键顺式元件为其远离起始密码子的第一个W-box元件，这为研究kaurlexins代谢调控机制提供了基础。
　　结论:本研究鉴定了三个玉米贝壳杉烯合酶基因，其中一个参与赤霉素生物合成，为玉米矮化突变体d5的突变基因，而另外两个能够被病原菌侵染和激素处理所诱导，可能参与植保素kauralexin生物合成，同时这三个基因在染色体上形成串联排列，应起源为基因复制，之后发生功能异化。对kauralexin代谢关键酶基因An2启动子活性进行了分析，确定了其关键顺式元件W-box。本研究鉴定的An2启动子顺式元件为后续玉米植保素kauralexin的代谢调控研究提供了基础。

目录

声明

摘要

英文缩写符号与中英文对照表

1 文献综述

1．1 赤霉素

1．2 植保素

1．3 萜类的生物合成途径

1．3．1 MVA与MEP途径

1．3．2 萜类合酶

1．3．3 赤霉素的生物合成

1．3．4 二萜植保素的合成途径

1．4 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料与处理

2．1．1 植物材料

2．1．2 植物材料的处理

2．1．3 实验菌株及载体

2．2 实验方法

2．2．1 数据的收集与分析

2．2．2 玉米基因组DNA的提取、启动子与基因组序列的克隆

2．2．3 玉米总RNA的提取、反转录与荧光定量PCR

2．2．4 基因的克隆与表达载体的构建

2．2．5 ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1在大肠杆菌中原核表达及产物的检测

2．2．6 ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1在烟草中的瞬时表达和亚细胞定位

2．2．7 玉米愈伤组织中的瞬时表达与启动子活性的验证

3 结果与分析

3．1 玉米中ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1的功能鉴定

3．1．1 ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1的基因信息与进化分析

3．1．2 ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1的贝壳杉烯合酶功能的鉴定

3．1．3 ZmKSL3、ZmKsL5和ZmTPS1在烟草中的亚细胞定位

3．1．4 d5突变体中ZmKSL3的鉴定

3．1．5 ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1基因的表达模式分析

3．2 Kauralexin合成途径中An2启动子活性的鉴定

3．2．1 An2启动子的顺式元件分析与克隆

3．2．2 An2启动子活性区域的鉴定

4 讨论

4．1 ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1均为贝壳杉烯合酶

4．2 ZmKSL3参与赤霉素的合成

4．3 ZmKSL5与ZmTPS1参与Kauralexins A1-A3的生物合成

4．4 ZmTPS1和ZmKSL5基因被胁迫诱导表达

4．5 An2启动子中特定W-box元件为其响应病原菌的调控靶点

参考文献

附录

致谢

硕士期间发表的学术论文