红豆杉体细胞杂交及其紫杉醇合成关键酶基因DBTNBT启动子功能分析

摘要

中药材有效成分的绝大多数来源于次生代谢产物，红豆杉次生产物--紫杉醇是一种高效抗癌药物。其野生资源匮乏，且紫杉醇含量极低，导致了紫杉醇的供应严重不足。利用不对称体细胞杂交技术可以转移并提高中药材有效成分，因此本文开展了狭叶柴胡与南方红豆杉的不对称体细胞杂交研究。
　　 主要实验结果如下：
　　 1.狭叶柴胡与南方红豆杉体细胞杂交
　　 1.1南方红豆杉胚性愈伤组织的获得及继代培养条件的优化
　　 以南方红豆杉种胚为外植体诱导出淡红色致密型及白色松散型愈伤组织，转移到MB2+B的培养基上，3-4次继代后获得颗粒状淡黄色的愈伤组织。将筛选得到的愈伤组织在MB2+B液体培养基培养，获得分散良好而生长迅速的淡黄色悬浮系，作为细胞融合材料。
　　 比较在不同激素组合及浓度的继代培养基上，红豆杉愈伤组织的生长状态及紫杉醇含量，结果表明添加2.0 mg/L2，4-D和1.0 mg/L6-BA的MB培养基上材料呈浅黄色，褐化较轻，生长旺盛，适合南方红豆杉的长期继代培养，且能维持较高的紫杉醇含量。
　　 1.2狭叶柴胡与南方红豆杉的细胞融合及融合再生克隆的生长
　　 选用南方红豆杉作供体，狭叶柴胡作受体，通过不对称融合（供体经380uw/cm2的UV照射lmin，2min，3min）的方法，获得了60个体细胞再生克隆。
　　 柴胡与红豆杉的不对称融合中，获得了融合组合I（供体UV照射lmin）再生克隆32个，融合组合Ⅱ（供体UV照射2min）再生克隆16个，融合组合Ⅲ（供体UV照射3min）再生克隆12个。再生克隆愈伤组织的生长速率及生长形态介于柴胡与南方红豆杉之间。
　　 1.3体细胞杂种的鉴定
　　 对上述再生克隆进行了同功酶、染色体、RAPD及SSR分析，确认了再生克隆I-18，I-19，I-27，I1-1，I1-2，I1-6，I1-9，ⅡI.2，Ⅲ-3为体细胞杂种。
　　 1.3.1酯酶同功酶
　　 酯酶同功酶分析表明，再生克隆均具有亲本柴胡特征带，克隆I-19，I-27，Ⅱ-3具有南方红豆杉的特征带及新带，I-18，Ⅱ.2，Ⅱ.6具有南方红豆杉的特征带，因此初步认为这些再生克隆为体细胞杂种。
　　 1.3.2染色体分析
　　 染色体分析表明，再生克隆的染色体数目分布为10-17条，其中，I-15，I-18，I-27，Ⅱ-2，I1-3染色体数目大于12条（受体柴胡染色体数目），因此，这些再生克隆为杂种克隆。
　　 1.3.3 RAPD分析
　　 40个随机引物的RAPD分析表明：1）再生克隆I-18/19/27，I1-1/2/6/9，Ⅱ1-2/3均含有双亲特征谱带或新带，为体细胞杂种克隆：2）杂种中保留了82.4％-96.8％的柴胡DNA谱带，4.62％-13.85％的南方红豆杉DNA谱带，表明杂种克隆的核基因组组成以受体柴胡为主，受体对杂种的核基因组贡献远大与于供体；3) UV剂量对杂种的核基因组组成具有明显效应，组合Ⅱ和组合Ⅲ的杂种中供体带比例及新带比例均高于组合I。其中克隆Ⅱ-6供体DNA谱带较多，南方红豆杉特征带和新带占其总带数的20.77％。
　　 1.3.4叶绿体SSR分析
　　 叶绿体SSR分析表明，除I-18，Ⅲ-2出现了新带外，其余杂种克隆仅有柴胡特征带。
　　 1.4体细胞杂种齐墩果酸含量变化分析
　　 对以上9个杂种克隆及其亲本愈伤组织进行了齐墩果酸含量分析，结果表明，Ⅱ-6、Ⅱ-9、Ⅲ-2和Ⅲ-3齐墩果酸含量高于亲本柴胡，其中Ⅲ-3齐墩果酸含量最高，是亲本柴胡的4.6倍，而杂种克隆I-18，I-19，I-27，Ⅱ-1，Ⅱ-2齐墩果酸含量均低于亲本柴胡。
　　 1.5杂种中齐墩果酸合成相关基因的表达模式分析
　　 选用齐墩果酸合成途径的5个上游基因（HMG-CoA合酶基因、IPP异构酶基因、FPP合成酶基因，鲨烯合成酶基因，鲨烯环氧酶基因）和3个分支基因（羽扇豆醇合成酶基因、环阿屯醇合成酶基因、B-amydn合成酶基因），对柴胡及杂种愈伤组织进行半定量RT-PCR分析，结果表明，不同杂种的齐墩果酸合成相关基因表达水平存在明显差异。其中Ⅱ-1，Ⅱ-2，Ⅱ-6的上游基因和羽扇豆醇合成酶基因表达水平均高于亲本及其它杂种。Ⅱ-2和Ⅲ-3的多个基因表达水平均稍高于柴胡，只有Ⅲ-3的环阿屯醇合成酶（分支酶）基因表达水平低于柴胡。
　　 紫杉醇合成途径相关酶基因大部分已克隆，其功能已经在原核大肠杆菌、真核酵母中得到验证。然而对紫杉醇合成途径中的转录调控研究则刚刚开始。紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转移酶(DBTN BT)催化紫杉醇生物合成途径最后一步反应，将紫杉醇前体去苯甲酰紫杉醇(3'-N-debenzoyltaxol)催化形成紫杉醇，但该酶基因转录水平明显低于代谢途径中的前期各个酶基因，因此DBTNBT被认为是紫杉醇合成途径的限速酶之一。该酶基因已被克隆，但其启动子功能及其反式作用元件的发掘研究尚未开展。本实验室已克隆了翻译起始位点上游1488 bp的DBTNBT启动子，在此基础上，本文研究DBTNBT基因启动子功能，并发掘该启动子上游的结合蛋白。
　　 主要实验结果如下：
　　 2.紫杉醇合成关键酶基因DBTNBT启动子的功能分析
　　 2.1 DBTNBT启动子的生物信息学分析
　　 NCBI的Blast比对发现，DBTNBT的启动子3’端与该基因cDNA的5’端非翻译区有35bp重叠序列，表明，克隆得到的1488bp长度序列为DBTNBT启动子序列。
　　 通过生物信息学分析，发现了该启动子上的一些重要顺式作用元件，包括MYC、WRKY等转录因子应答元件以及MeJA应答元件。
　　 2.2 DBTNBT启动子功能验证
　　 2.2.1启动子5’缺失和3’缺失片段与GUS融合表达载体的构建
　　 通过用该启动子的5’缺失和3’缺失片段替换GUS表达载体pCAMBIA1304的35S启动子区，构建了1个该启动子全长与GUS基因融合的植物表达载体pDtA::GUS，5个该启动子的5’缺失片段表达载体pDtB::GUS、pDtC::GUS、pDtD::GUS、pDtE::GUS、pDtF::GUS，及2个3’缺失片段表达载体pDtG::GUS、pDtH::GUS。
　　 2.2.2启动子在洋葱表皮细胞中的瞬时表达检测
　　 利用基因枪法将含有DBTNBT启动子全长片段A和GFP基因的融合载体pDtA::GFP转化洋葱表皮细胞，发现GFP在洋葱表皮的细胞质中表达，表明该启动子具有启动子驱动活性。
　　 2.2.3启动子在烟草叶片中瞬时表达分析
　　 通过GUS的组织化学染色和GUS荧光定量技术，分析了启动子全长及缺失片段A-G在烟草叶片中驱动GUS基因表达情况。结果表明，启动子片段A-H均在烟草叶片中驱动GUS表达，其中，5’缺失片段C(-696～lbp)具有最高的启动能力，其启动的GUS活性是D(-406～-lbp)的7.1倍、A(-1488～-1bp)的2.2倍、B(-1013～-lbp)的3.8倍。推测在启动子-696～-406区域是其增强表达区，而B-C(-1013～-696bp)是其负调控区域。
　　 2.2.4启动子的稳定表达分析
　　 利用农杆菌侵染法，将pDtA::GUS、pDtB::GUS、pDtC::GUS、pDtD::GUS表达载体分别转入烟草，获得了A、B、C、D类转基因烟草植株。对转基因烟草的GUS活性分析表明，B类转基因烟草GUS活性最高，其活性是A类的7.5倍、C类的283.6倍、D类的73.7倍，表明，片段B-C区（-1013～-696bp）是该启动子的正调控区域，该结果与启动子的瞬时表达分析结果有差异。
　　 GUS表达水平为：A、B类转基因烟草茎、叶大于根；C、D类转基因烟草根大于茎、叶。表明，该启动子不同缺失片段驱动的GUS表达具有组织特异性。推测，在A-C（-1488～-696bp）区间具有受光诱导的增强表达顺式作用元件。
　　 2.3酵母单杂克隆DBTNBT启动子上游的结合蛋白
　　 利用酵母单杂技术分离到与DBTNBT启动子P1(-1488～-1005bp)区域结合的7个结合蛋白，其所属家族包括：组蛋白家族(Histone)、酪氨酸激酶(BTK)家族、Ubiquitin家族以及3个未知功能蛋白；与P3(-706～-398bp)区域结合的5个蛋白因子所属家族包括：BetVI-family、Rieske家族、UEP家族、Proteaseinhibitor/seed storage/LTP family及1个未知功能蛋白；与P4(-417～-175bp)区域结合的4个蛋白因子所属家族包括：组蛋白家族、具有生物素羧化酶C-端功能域蛋白家族及2个未知功能蛋白。其中BetVI-family为病原相关蛋白及酪氨酸激酶(BTK)可能对DBTNBT启动子的转录调控具有作用，其作用机制需进行进一步的验证。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 文献综述

1 紫杉醇开发研究进展

1.1 紫杉醇的研发历史

1.2 紫杉醇的结构、性质及其作用机制

1.3 红豆杉在国内外的分布和种植状况

1.4 紫杉醇开发研究近况

1.5 紫杉醇生物合成途径研究进展

2 植物体细胞杂交技术的研究进展

2.1 体细胞杂种重要性状的转移

2.2 体细胞杂交技术在药用植物中的研究进展

2.3 体细胞杂种的鉴定方法

2.4 药用植物-柴胡的研究进展

3 启动子及转录因子研究进展

3.1 真核启动子的特点

3.2 植物基因工程中常用的启动子

3.3 启动子的克隆方法

3.4 启动子功能分析方法

3.5 转录因子的研究进展

4 研究背景及立题意义

第二章 柴胡与南方红豆杉不对称体细胞融合

1 材料与方法

1.1 柴胡与南方红豆杉的原生质体融合

1.2 同工酶分析

1.3 染色体制片及观察

1.4 RAPD分析

1.5 SSR分析

1.6 半定量RT-PCR

1.7 HPLC测定药效含量

2 结果与分析

2.1 红豆杉培养条件的优化

2.2 柴胡与红豆杉体细胞杂交

2.4 齐墩果酸合成途径基因的半定量RT-PCR分析

2.5 柴胡及部分杂种克隆齐墩果酸含量分析

3 讨论

3.1 杂种中核基因组组成的影响因素

3.2 杂种齐墩果酸合成相关基因的表达模式及与齐墩果酸含量的关系

第三章 DBNTBT启动子的功能分析

1 材料与方法

1.1 植物表达载体的构建

1.2 农杆菌介导的烟草遗传转化

1.3 启动子的瞬时表达分析

1.4 基因枪法介导的目的蛋白的细胞定位

1.5 酵母单杂交

2 结果与分析

2.1 启动子的分离

2.2 DBTNBT启动子的结构分析

2.3 DBTNBT启动子全长及57端和3’端缺失植物表达载体构建

2.4 DBTNBT启动子启动GFP蛋白在洋葱表皮细胞中瞬时表达

2.5 DBTNBT启动子启动GUS基因在烟草叶片中的瞬时表达

2.6 含有不同长度DBTNBT启动子转基因烟草的获得

2.7 DBTNBT启动子的组织表达模式

2.8 MeJA对启动子的诱导作用分析

2.9 启动子上游结合蛋白的克隆

3 讨论

3.1 DBTNBT启动子可能的调控方式

3.2 DBTNBT启动子的功能缺失研究

3.3 启动子瞬时表达与稳定表达出现差异的原因分析

3.4 酵母单杂交试验中的假阳性和假阴性

参考文献

致谢

学位论文评阅及答辩情况表