FHL2基因在鸡骨骼肌卫星细胞增殖与分化中的作用研究

摘要

FHL2(Four and a Half LIM protein2)属于FHL蛋白家族的成员，是一种只含有四个半LIM结构域的蛋白质。已有研究表明，FHL2直接或间接参与调控卫星细胞增值与分化相关重要通路（Wnt/β-catenin、TGFβ）的信号转导过程，且该基因在鸡出生后不同阶段的胸肌中表达呈现显著差异，推测FHL2基因可能为调控鸡骨骼肌卫星细胞增殖分化的重要因子。因此，本研究通过对体外培养的原代鸡胸肌卫星细胞进行FHL2 SiRNA的转染处理，观察对转染不同时间点(12h、24h、48h和72h)的肌卫星细胞增殖与分化形态，并通过RT-PCR技术检测转染后(12h、24h和48h)相关成肌调节因子以及Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三条重要信号转导通路中关键基因的mRNA表达，以及采用Western-Blot检测了FHL2、MYH7B以及NUMB蛋白在转染后(24h、48h和72h)的蛋白表达情况。结果表明:
　　(1)细胞形态学变化:转染后12h，三个试验组细胞在形态学上没有明显的差异;24h后，处理组的卫星细胞数量明显少于两个对照组，对照组细胞极少部分出现分化;48h后，两个对照组细胞长满且大量分化，而处理组细胞少量增殖且仅有极少数细胞开始分化;72h后，两个对照组完全分化且出现肌管，而处理组的细胞数量无明显变化，部分细胞开始分化，但无肌管出现。
　　(2)成肌调节因子的mRNA表达:在转染12h和24h后，处理组中FHL2的mRNA表达显著低于两个对照组(P＜0.05);转染后12h，处理组中成肌调节因子MyoD和MyoG的mRNA表达量显著低于两个对照组(P＜0.05);转染后24h，处理组中MyoG和MYHC的mRNA表达量显著低于两个对照组(P＜0.05);三个试验组中MRF4的表达量在转染后的三个时间点均差异不显著(P＞0.05)
　　(3) Notch信号通路:转染12h后，处理组中hairy1的mRNA表达量显著低于空白对照组和阴性对照组(P＜0.05);转染24h后，处理组中Notch2、Hey1以及hairy1的mRNA表达量显著或极显著低于对照组(P＜0.05或P＜0.01);转染48h后，处理组中NUMB的mRNA表达量极显著低于另两个组(P＜0.01);
　　(4) TGFβ信号通路:关键基因ACVR1的mRNA表达量在转染12h时处理组显著低于两个对照组(P＜0.05);ACVR2的mRNA表达量则在转染后三个时间点中均为处理组显著低于两个对照组(P＜0.05);
　　(5) Wnt/β-catenin信号通路:转染12h后，处理组中β-catenin、Wnt2b以及Wnt4的mRNA表达量显著或极显著低于对照组(P＜0.05或P＜0.01);转染24h后，处理组中Wnt4和Wnt6的mRNA表达量极显著低于对照组(P＜0.01);转染48h后，处理组中GSK3β和Wnt5a的mRNA表达量极显著低于对照组(P＜0.01)。
　　(6) Western-Blot检测表明:转染48h后，处理组中FHL2蛋白和MYH7B蛋白的表达量明显低于空白对照组和阴性对照组;在转染72h后，处理组中NUMB蛋白的表达量明显低于两个对照组。
　　综上，转染FHL2 SiRNA后，鸡骨骼肌卫星细胞的增殖和分化均受到明显的抑制，FHL2的表达量降低下调部分成肌因子的表达，Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三条通路的信号转导也受到不同程度的抑制。因此，本研究推测FHL2基因可能通过Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三条通路的信号转导来调控鸡骨骼肌卫星细胞的增殖和分化，从而影响鸡肌肉的生长。

目录

论文说明

声明

摘要

英文缩写词

1 文献综述

1．1 骨骼肌发育与卫星细胞

1．1．1 骨骼肌发育过程

1．1．2 骨骼肌卫星细胞

1．1．3 影响卫星细胞增殖分化的相关基因和信号通路

1．2 FHL2与肌卫星细胞

1．2．1 FHL2概述

1．2．2 FHL2基因在骨骼肌发育和再生中的研究进展

1．2．3 FHL2与肌卫星细胞增殖分化调控

1．3 本试验的目的与意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验试剂与耗材

2．2．1 荧光标记SiRNA

2．2．2 主要试剂及试剂盒

2．2．3 常用试剂的配制

2．2．4 主要仪器设备

2．2．5 主要应用的生物学软件

2．3 试验方法

2．3．1 cDNA模板的制备

2．3．2 FHL2基因CDS区的获得以及不同组织中的半定量分析

2．3．3 细胞试验

2．3．4 转染细胞荧光定量PCR

2．3．5 转染细胞蛋白Western Blot

2．3．6 数据统计分析

3 结果与分析

3．1 FHL2基因CDS区序列与不同组织中的表达情况

3．1．1 FHL2基因CDS区序列

3．1．2 FHL2基因在各组织中表达检测

3．2 鸡原代骨骼肌卫星细胞(SMSCs)形态学观察

3．3 FHL2转染SiRNA位点的选取

3．4 干扰FHL2对鸡骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

3．5 干扰FHL2对调控骨骼肌卫星细胞发育相关成肌调节因子及通路关键基因表达量的影响

3．5．1 转染后不同时间点FHL2基因表达量变化

3．5．2 干扰FHL2对卫星细胞中成肌调节因子的影响

3．5．3 干扰FHL2对卫星细胞相关信号通路关键基因的影响

3．6 干扰FHL2对部分卫星细胞分化相关基因蛋白表达量的影响

4 讨论

4．1 FHL2基因对鸡卫星细胞增殖与分化的影响

4．1．1 FHL2基因在鸡体内各组织的表达

4．1．2 FHL2基因对卫星细胞形态学的影响

4．1．3 FHL2基因对卫星细胞增殖分化相关成肌调节因子的影响

4．2 FHL2基因影响鸡卫星细胞增殖与分化的主要作用信号通路

4．2．1 FHL2基因对Wnt／β-catenin信号通路的调控

4．2．2 FHL2基因对TGFβ信号通路的调控

4．2．3 FHL2基因对Notch信号通路的调控

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士研究生期间发表的论文和专利