灰葡萄孢菌和紫外诱导葡萄抗毒素白藜芦醇合成及代谢的研究

摘要

葡萄是一种具有重要经济价值的水果，葡萄和葡萄酒中营养成分丰富。葡萄灰霉病是葡萄生产和贮藏中的重要病害之一，可导致葡萄减产15％～50％左右，严重时甚至绝产。近年来，生产上主要防治措施为化学农药防治、选育抗病品种以及生物防治等，但是由于易造成环境污染、农药残留、耐药性、耗时长、稳定性差以及防效低等问题，因此通过提高葡萄自身免疫水平或钝化或抑制病原菌的活性以抵抗病原菌为害的优势越发突出。
　　白藜芦醇是葡萄遇到病原菌侵染或逆境时产生的一类特殊的抗毒素，研究发现，白藜芦醇的含量与葡萄对病原菌或逆境胁迫的抗性呈正相关，因此目前白藜芦醇被公认为葡萄抗病程度的重要指标之一。除白藜芦醇外，其代谢产物也与葡萄抗病性有关，据报道，白藜芦醇的糖基化产物piceid几乎无抗菌能力，但其氧化产物二聚体viniferin的抗菌能力更强，但是关于其代谢物viniferin的机制研究的较少。漆酶是灰霉菌产生的一类重要致病蛋白，具有将白藜芦醇氧化成viniferin的能力，其漆酶的产量及活性与灰霉菌的致病性强弱有关。紫外照射是诱导白藜芦醇大量合成与代谢的主要方法之一，因此研究葡萄在灰霉菌和紫外诱导下白藜芦醇的合成及代谢，以及灰霉菌产漆酶对白藜芦醇的催化机制，对于了解葡萄抗毒素白藜芦醇的抗病机制、灰霉菌漆酶与白藜芦醇的互作机制、葡萄抗病品种的选育和利用以及灰霉病的防治具有一定的理论价值和应用价值。
　　本研究以来源于不同寄主植物的53株灰霉菌和3个葡萄品种（夏黑、巨峰和法葡）为试验材料，研究了不同寄主来源的灰霉菌产漆酶的能力和酶活力，并对灰葡萄孢菌SP4菌株的生长速率和致病性进行检测，利用HPLC分析了葡萄叶片和果实在灰葡萄孢菌SP4或紫外诱导下白藜芦醇的积累情况，并利用qRT-PCR技术检测了灰葡萄孢菌SP4或紫外诱导下葡萄抗病基因的表达情况。主要研究结果如下:
　　(1)对不同寄主来源的灰霉菌菌株的产漆酶能力及酶活性检测发现，所有菌株均具有产漆酶的能力，其中，以YSD2菌株产漆酶能力最小，SYYK112产漆酶能力最大。对不同菌株漆酶酶活检测发现，菌株YM3产漆酶酶活最大，而菌株YSD1酶活最小，同时，不同菌株产漆酶的能力与酶活无明显相关性。其中，灰葡萄孢菌SP4菌株在培养20天时漆酶酶活最大，其生长速度为11.8（mm/d），该菌株可引起三种葡萄叶片和果实不同程度发病。
　　(2)通过灰葡萄孢菌SP4接种和紫外处理葡萄叶片后观察发病情况发现，接菌三个葡萄品种后，巨峰发病最早，病斑扩展速度也最快，表明巨峰抗病性最差。紫外处理后，巨峰叶片损伤最大，法葡的损伤最小，表明巨峰抗紫外胁迫能力较差，夏黑次之，法葡最好。
　　(3)采用HPLC检测灰葡萄孢菌SP4诱导和紫外处理后三个葡萄材料叶片或果实中白藜芦醇(Resveratrol，Res)及其代谢产物含量发现，SP4可诱导三个葡萄材料叶片Res及其代谢衍生物糖苷Piceid(PD)和二聚体ε-viniferin合成，不同葡萄品种中各产物随接种时间变化趋势不同，以48h或96h或168h含量最高。表明灰葡萄孢菌诱导葡萄叶片Res合成后主要代谢为PD和ε-viniferin。同时，灰葡萄孢菌能诱导夏黑和巨峰果皮中Res合成，其合成量低于叶片。采用不同时间紫外诱导葡萄叶片后，Res、PD、PS和ε-viniferin合成量均增加，且与紫外照射时间呈正相关，其中，Res的合成量均显著高于PD、PS和ε-viniferin，表明葡萄叶片中Res的累积是代谢合成PD、PS和ε-viniferin的前提条件。紫外诱导后比较不同葡萄品种各产物含量发现，Res和ε-viniferin的合成量均为:法葡＞夏黑＞巨峰。比较两种处理发现，紫外处理后的叶片中Res和PD合成量均显著高于灰葡萄孢菌接菌，表明紫外照射对白藜芦醇合成及代谢的诱导作用更强。同时，除法葡外，夏黑和巨峰叶片中PS的含量都显著增加，表明PS可能是葡萄叶片在紫外诱导下的芪化物响应因子。
　　(4)采用qRT-PCR法对灰葡萄孢菌SP4和紫外处理后不同葡萄抗病相关基因表达情况进行研究，结果显示:接菌后，夏黑和巨峰叶片中RS、STS、PAL、 MYBBF2和MYB14F基因表达量变化趋势基本一致:夏黑与巨峰均不表达，法葡表达先增加后减少，且在24 h或48 h时表达最大。三个葡萄材料中PGIP、PR5和PR10基因的变化趋势一致（除巨峰叶片中PGIP基因不表达外），都为先增加后减少的表达趋势，且PR10基因的表达量最大。紫外处理后的叶片中，除巨峰叶片中RS基因不表达和法葡叶片中MYBBF2、MYB14F和PR5基因在30min表达量达最大值外，其它抗病相关基因均呈连续增加表达的变化趋势，在60min达最大值，且基因PR10的表达量最高。结果表明，两种处理均能诱导葡萄抗病相关基因上调表达。相关基因的上调表达均在Res及其衍生物大量合成之前或同时表达，且表达量以法葡最高，夏黑次之，巨峰最低，说明白藜芦醇合成及代谢受相关基因的调控，且抗性法葡强于夏黑强于巨峰。

目录

声明

摘要

一、文献综述

1．葡萄灰霉病研究进展

1．1 葡萄灰霉病的发生及为害

1．2 葡萄灰霉病病原菌及其生物学特性

1．3 葡萄灰霉病侵染循环特点

1．4 灰葡萄孢茵的致病因子

1．5 葡萄灰霉病防治

2．漆酶研究进展

2．1 漆酶的来源与分布

2．2 漆酶功能的研究及应用

2．3 真菌漆酶的研究

3．葡萄抗病机制研究进展

3．1 抗毒素白藜芦醇

3．2 葡萄病程相关蛋白

4．实时荧光定量PCR研究进展

5．研究的目的与意义

6．试验的技术路线图

二、材料与方法

1．材料

1．1 病原菌材料

1．2 葡萄叶片和果实的准备

1．3 培养基的制备

1．4 药品及试剂

1．5 仪器设备

2．方法

2．1 不同灰霉菌菌株产漆酶的活性检测

2．2 灰霉菌菌株SP4形态学、生长速率及致病性检测

2．3 灰葡萄孢菌诱导葡萄叶片白藜芦醇合成及代谢的研究

2．4 灰葡萄孢菌诱导葡萄果皮白藜芦醇含量的检测

2．5 紫外诱导葡萄叶片白藜芦醇合成及代谢的研究

三、结果与分析

1．不同灰霉菌菌株产漆酶的活性检测

1．1 不同灰霉菌菌株产漆酶的定性检测结果

1．2 不同灰霉菌菌株产漆酶的定量检测结果

1．3 SP4产漆酶活性动态变化结果

2．灰霉菌菌株SP4的鉴定

2．1 SP4的形态学特征

2．2 SP4菌丝生长速率测定结果

2．3 SP4致病性检测结果

3．灰葡萄孢菌诱导葡萄叶片白藜芦醇合成及其代谢的研究

3．1 葡萄叶片接菌后的发病症状观测

3．2 灰葡萄孢菌诱导葡萄叶片白藜芦醇的提取方法及HPLC条件优化结果

3．3 灰葡萄孢菌诱导的葡萄叶片白藜芦醇及其代谢产物的检测结果

3．4 实时荧光定量PCR检测葡萄抗病基因表达情况

4．灰葡萄孢菌诱导葡萄果皮白藜芦醇含量的检测

4．1 夏黑和巨峰接种灰葡萄孢菌后的发病特征观测结果

4．2 葡萄果皮白藜芦醇的提取方法及HPLC条件优化结果

4．3 灰葡萄孢菌诱导葡萄果皮白藜芦醇合成的检测结果

5．紫外诱导葡萄叶片白藜芦醇合成及其代谢的研究

5．1 葡萄叶片紫外诱导后的发病情况

5．2 紫外诱导的葡萄叶片白藜芦醇的提取方法和HPLC条件优化结果

5．3 紫外诱导的葡萄叶片白藜芦醇及其代谢产物的检测结果

5．4 实时荧光定量PCR检测葡萄抗病基因表达结果

四、讨论与结论

1．不同灰霉菌菌株产漆酶能力和酶活力不同

2．灰葡萄孢菌对葡萄不同部位白藜芦醇合成的诱导作用不同

3．灰葡萄孢菌和紫外处理对葡萄白藜芦醇合成及代谢的诱导作用不同

4．葡萄抗病基因对灰葡萄孢菌和紫外处理的诱导反应不同

5．小结

参考文献

致谢