似鲇高原鳅传染性溃疡症病原学研究

摘要

2014年2～3月，四川乐山某似鲇高原鳅养殖场暴发一种流行性传染病，死亡率达30％，主要临床特征为体表褪色，皮肤多处溃疡，腹部出血，鳃丝充血、肿胀与断裂等。为明确其病因，本研究在病理学检查的基础上，开展了病原学的研究。患病鱼剖检见血色腹水，肝脏肿大，可见坏死灶，肠腔内见淡黄色粘液，脑膜充血、出血，脾与肾肿大。组织病理学观察发现，皮肤坏死，肌间隙增宽、水肿，肌细胞变性、坏死、溶解;心肌出血;鳃上皮细胞肿胀、脱落，部分鳃小片增生连成板状;脾淋巴细胞数量减少，含铁血黄素沉着;肾间造血组织坏死、出血，炎症细胞浸润，肾小管上皮细胞变性、坏死;肝索结构紊乱，中央静脉淤血，肝细胞变性，灶性坏死;脑膜水肿，脑基质疏松呈“海绵状”，神经细胞肿胀，核固缩，小胶质细胞增生。
　　取病鱼的鳃、体表粘液和溃疡坏死物涂片镜检，未发现寄生虫与真菌。肝、肾和脾触片后革兰氏染色，镜检也未发现细菌。无菌条件下，取病鱼的肝、肾和脾组织分别划线接种LB平板和BHI平板，28℃恒温培养48 h，未见细菌生长。将病鱼的肝、肾和脾组织研磨过滤菌后接种到鲤鱼上皮瘤细胞(epitheliomapapulossum of carp，EPC)，盲传3代出现坏死，脱落，形成空斑等典型细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，收集细胞液，离心，取上清液继续接种EPC细胞，分离到一株病毒。将分离病毒液分别腹腔和肌肉注射20尾健康似鲇高原鳅，试验鱼出现与自然发病鱼相同的症状而对照组无异常，证实分离病毒为该病的病原。取细胞病毒液电镜下观察，发现病毒颗粒呈单个或多个晶格状排列分布，单个病毒颗粒为正六边形，对称20面体，对角线直径约103±7 nm，与虹彩病毒颗粒形态相似。分离病毒在EPC细胞中增殖，其TCID50值能达到105.4/0.1mL，用BrdU处理分离病毒，病毒滴度下降了4.4个单位，病毒分别经过乙醚、酸、碱、胰蛋白酶和热处理后，其TCID50均下降2个单位以上，表明病毒粒子具有囊膜，对酸、碱、热和胰蛋白酶敏感。合成一对虹彩病毒主要衣壳蛋白(maiorcapsidprotein，MCP)基因的引物(5'-GAC TTG GCC ACT TAT GAC-3'，5'-GTCTCT GGA GAA GAA GAA-3')，对出现CPE的细胞及自然发病鱼的内脏器官进行PCR检测，均能扩增出约500bp的特异性条带，扩增产物测序后在GenBank中进行NCBI-Blast比对，发现扩增序列与蛙病毒属病毒的同源性最高，达97％以上。
　　为进一步明确分离病毒的分类地位，分别设计蛙病毒MCP、DNApol、RNR-α和RNR-β基因的4对引物对分离病毒的相应基因进行PCR扩增、T-克隆、测序及系统发育分析。在基于以上4个基因序列与GenBank中部分同源性较高的序列构建的系统发育树上，分离病毒与中国大鲵蛙病毒(Chinese giant salamandervirus CGSV)、苏黎世侧褶蛙蛙病毒(Zuerich pelophylax collection ranavirus，ZPCR)、梭鲈虹彩病毒(Pike-perch iridovirus，PPIV)和蛙病毒3型(Frog virus3，FV3)等聚类，其中与CGSV聚为一支。在联合以上4个基因构建的多基因系统发育树上，分离病毒更接近于两栖类蛙病毒亚群。本研究利用EPC细胞从患病似鲇高原鳅体内分离到一株病毒，经人工感染试验，形态学、理化性质和分子生物学鉴定确认似鲇高原鳅传染性溃疡症的病原是蛙病毒属成员，这是首次报道蛙病毒可自然感染似鲇高原鳅并致死。

目录

声明

摘要

一、文献综述

1 似鲇高原鳅及其疾病研究概况

1．1 似鲇高原鳅的生物学特性

1．2 似鲇高原鳅的疾病概况

2 鱼类溃疡症的病因

2．1 传染性溃疡症

2．2 非传染性溃疡症

3 蛙病毒概述

3．1 蛙病毒的生物学特性

3．2 蛙病毒的分布和宿主范围

3．3 蛙病毒感染的病理损伤

3．4 蛙病毒的诊断与防治

4 本研究的目的与意义

二、实验材料和方法

1 材料

1．1 实验动物

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

2 方法

2．1 临床症状及显微镜检查

2．2 自然感染似鲇高原鳅的病理学检查

2．3 病原分离

2．4 回归试验

2．5 病毒鉴定

2．6 主要功能基因T-克隆及进化分析

三、实验结果

1 临床症状及显微镜检查

2 组织病理学观察

3 病原分离

3．1 细菌分离

3．2 病毒分离

4 回归试验

5 病毒鉴定

5．1 分离病毒的形态学观察

5．2 分离病毒的理化性质鉴定

5．3 分离病毒的PCR检测

6 鳅源蛙病毒主要功能基因的克隆及进化分析

6．1 PCR扩增结果

6．2 分离病毒进化分析

四、讨论

1 溃疡症的病因

2 蛙病毒感染的病理损伤

3 蛙病毒的形态发生学与细胞损伤

4 蛙病毒的进化分析

五、结论

参考文献

致谢

作者攻读硕士学位期间发表的学术论文