牦牛骨胶原多肽螯合钙的制备研究

摘要

本研究以牦牛骨粉为原料制备牦牛骨胶原多肽螯合钙。以多肽得率为主要指标，筛选出酶解牦牛骨效果最好的酶进行酶解，通过单因素试验和响应面试验优化该酶的酶解条件得到酶解法制备的牦牛骨胶原多肽;从酶解后的牦牛骨粉中提取可溶性骨钙，通过单因素和响应面试验优化提取条件;在此基础上对自制多肽、骨钙进行螯合，利用单因素和响应面试验优化螯合条件;再用紫外扫描分析、红外光谱分析、x射线衍射分析、电镜扫描对制备的多肽、多肽螯合钙进行结构对比分析，对牦牛骨胶原多肽螯合钙的消化特性和稳定性进行研究。结果如下。
　　筛选出碱性蛋白酶为最优酶，最佳酶解条件为底物浓度3.5％，酶底比4000U/g，pH7.0，酶解时间4h，酶解温度50℃，此时多肽得率为22.06％。
　　选取盐酸作为提取骨钙的最优用酸，最佳提取条件为温度67℃，时间75min，盐酸浓度1mol/L，盐酸用量18mL，此条件下提取出的钙含量为112.18mg/g。
　　确定骨钙作为螯合的钙源，将骨钙与超滤后的各分子量段的肽进行螯合，发现2kD到5kD的肽的螯合率最高。获得最佳螯合条件为肽钙质量比2∶1，pH8.0，多肽浓度25mg/mL，螯合时间90min，螯合温度45℃，此时的螯合率为76.04％。
　　紫外扫描分析发现胶原多肽与钙螯合后生成了新的物质;红外光谱分析发现螯合钙的特征基团吸收峰出现了红移、蓝移、消失和新增，胶原多肽与钙发生了螯合反应，推测其位点是胶原多肽侧链氨基、羧基和内部肽键;x衍射分析发现多肽经过螯合后产生了新的吸收峰，进一步证明了螯合反应的发生;电镜扫描发现螯合前后样品形态、质地发生了改变。
　　对螯合钙进行稳定性分析发现螯合钙在碱性、中性环境下稳定性较高，酸性稍低。80℃的高温处理10min到60min对其稳定性没有显著影响。模拟胃肠道消化试验结果表明螯合钙在模拟胃环境中消化两小时过程中，钙缓慢释放;后再经模拟肠道消化后钙溶解率逐渐降低，最后维持在50％左右。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 牦牛骨资源概况

1．1．1 牦牛骨营养价值与结构特点

1．1．2 牦牛骨利用现状

1．2 钙制剂研究现状

1．2．1 钙的生理功能

1．2．2 钙的摄入

1．2．3 钙制剂的发展现状

1．3 多肽螯合钙研究进展

1．3．1 螯合钙定义和螯合机理

1．3．2 多肽螯合钙的优势

1．3．3 多肽螯合钙的制备

1．3．4 螯合钙的初步分离与结构分析

1．3．5 多肽螯合钙的功能评价

1．4 本研究目的与意义

1．5 研究目标与内容

2 材料与方法

2．1 实验试剂与材料

2．2 仪器设备

2．3 方法

2．3．1 牦牛骨胶原多肽酶解条件优化

2．3．2 牦牛骨可溶性钙提取条件优化

2．3．3 肽、钙螯合条件优化

2．4 指标测定

2．4．1 牦牛骨粉蛋白质含量测定

2．4．2 酶活的测定

2．4．3 水解度的测定

2．4．4 可溶性多肽得率测定

2．4．5 钙含量测定

2．4．6 螯合率测定

2．4．7 稳定性测定

2．5 统计分析

3 结果与分析

3．1 牦牛骨粉蛋白含量测定结果

3．2 酶活测定结果

3．3 牦牛骨胶原酶解条件优化结果

3．3．1 最优酶筛选结果

3．3．2 最适酶单因素试验

3．3．3 最适酶响应面优化试验

3．4 牦牛骨可溶性钙提取条件优化结果

3．4．1 骨中钙含量测定结果

3．4．2 最优酸筛选结果

3．4．3 可溶性钙提取单因素试验结果

3．4．4 可溶性钙提取条件响应面优化结果

3．5 多肽、钙螯合条件优化结果

3．5．1 不同钙源螯合效果比较结果

3．5．2 不同分子量多肽与骨钙鳌合效果比较结果

3．5．3 螫合单因素试验结果

3．5．4 螯合条件响应面优化试验结果

3．5．5 牦牛骨胶原多肽螯合钙初步鉴定结果

3．5．6 牦牛骨多肽螯合钙结构分析结果

3．5．7 螯合钙稳定性试验结果

3．5．8 模拟胃肠道消化试验结果

4 讨论与结论

4．1 讨论

4．1．1 牦牛骨粉酶解制备骨胶原多肽

4．1．2 骨钙的提取

4．1．3 肽钙的螯合

4．1．4 螯合钙的分离与结构表征

4．1．5 螯合钙的稳定性和功效评价

4．2 结论

5 问题与展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文