神经生长因子NGF在绿壳蛋鸡卵泡和输卵管中的表达及对卵泡发育的调控

摘要

鸟类的排卵过程为卵巢发育成熟并产生成熟的卵泡，卵泡脱离卵巢通过输卵管的各个部分形成完整的蛋，并最终排出。而在这个过程中卵巢和输卵管受到诸多的生长因子和激素的调控。通过选育培养出的蛋鸡在进入高产期后几乎每天产蛋，其原因在于蛋鸡卵泡在生殖阶段可持续发育、并排卵和受精，卵巢排卵后亦不形成黄体，生殖周期极短，是作为生殖系统研究的理想试验动物。本试验以中国地方特色蛋鸡品种绿壳蛋鸡为试验材料，测定不同产蛋时期的等级前卵泡、优势等级卵泡和输卵管中的神经生长因子NGF及其受体的mRNA表达量，并对产蛋期和就巢期的组织进行NGF及其受体的表达对比，同时通过体外培养的方式对绿壳蛋鸡的F1卵泡颗粒细胞培养并添加NGF蛋白，测定各个受体的mRNA表达量和性腺激素的分泌量。结果如下:
　　通过对绿壳蛋鸡不同产蛋阶段(19W、33W、50W、64W)的生殖组织进行采样并提取mRNA，并进行荧光定量对其卵泡和输卵管的NGF及其受体的mRNA表达量测定。结果表明:NGF在绿壳蛋鸡各个产蛋时期中的卵泡和输卵管中都有表达;在等级前卵泡中，除了产蛋末期外，其他时期的小白卵泡SWF的NGF和其高亲和力受体酪氨酸激酶A(TrkA)的mRNA表达量要显著高于其他等级前卵泡(P＜0.05)，且随着等级前卵泡的发育，NGF的表达量呈现下降的趋势，而在整个产蛋时期中，NGF在产蛋高峰期表达量最高;在等级卵泡中，NGF及其受体在F4卵泡中表达量在各时期都较高，且在产蛋前期和高峰期，F1-F4的mRNA表达量都高于F5的mRNA表达量，而在整个产蛋周期中，NGF的表达量在产蛋高峰期处于峰值;每个时期的输卵管各部位都有NGF的表达，且表达量随着绿壳蛋鸡产蛋周期的变化而变化，在产蛋后期NGF及其高亲和力受体表达量最高。以上结果说明，NGF的表达量与蛋鸡的生殖状况和产蛋性能相关，推测NGF可能参与了调控卵巢和输卵管生长发育并有助于蛋鸡产蛋。
　　利用荧光定量测定方法对绿壳蛋鸡产蛋期和就巢期各组织的NGF及其受体的表达进行研究。结果表明:产蛋期的卵巢大于就巢期卵巢，且具有小黄卵泡SYF和F1-F6卵泡，而就巢期卵巢处于萎缩形态，没有优势卵泡;在产蛋期的卵巢基质中，NGF及其受体显著高于就巢期(P＜0.05);在等级前卵泡中，SWF和LWF中的NGF及其高亲和力受体在产蛋期的mRNA的表达量显著高于就巢期（P＜0.05）。以上结果说明NGF及其受体在卵巢组织中的表达与禽类产蛋周期有影响，并可能参与了禽类产蛋时期与就巢时期的调控，NGF的表达有助于激活非发情期卵巢并改变卵巢形态，促使等级前卵泡发育成为等级优势卵泡。
　　通过对F1卵泡颗粒细胞离体培养，添加NGF蛋白并进行受体基因的荧光定量及激素的Elisa检查，探究NGF蛋白在蛋鸡卵泡发育过程中的作用。结果表明:在添加不同浓度NGF蛋白处理后，颗粒细胞中的p75受体的表达量显著升高(P＜0.05)，且随着NGF蛋白的浓度升高而升高;处理不同浓度的NGF蛋白后，颗粒细胞中的FSHR和LHR也显著升高（P＜0.05），且存在正相关关系;通过Elisa检查发现，添加NGF蛋白处理后的颗粒细胞中雌激素的分泌显著升高（P＜0.05），而孕激素则相反;在依次添加NGF和FSH处理后发现，雌激素的分泌在单独添加NGF和FSH时都将显著升高（P＜0.05），而且同时添加有叠加效果，而孕激素的分泌则相反。以上结果表明，NGF在禽类卵泡中能促进其LHR和FSHR的表达，通过加强细胞对激素的敏感性来调控卵泡的发育和排卵，并且影响动物的生理周期。
　　综上所述，NGF及其受体能促进禽类早期卵巢和输卵管的生长和发育，并在卵巢和输卵管成熟后，促进卵巢卵泡的发育以及排卵，同时在也影响鸡的生殖周期。

目录

论文说明

声明

摘要

缩写对照表

1 文献综述

1．1 NTs家族及其受体

1．1．1 NTs家族成员

1．1．2 NTs家族受体

1．1．3 NTs家族与其受体的结合方式

1．2 神经生长因子及其受体

1．2．1 神经生长因子结构

1．2．2 神经生长因子受体结构

1．2．3 神经生长因子的作用机制

1．3 神经生长因子及其受体在雌性生殖系统中的作用

1．3．1 卵巢

1．3．2 输卵管

1．4 禽类生殖系统的发育

1．4．1 禽类的卵泡发育

1．4．2 禽类输卵管发育

1．4．3 性腺激素

1．5 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物选择

2．1．2 主要试剂及试剂盒

2．1．3 主要试剂配制

2．1．4 主要仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 样品采集

2．2．2 鸡卵巢颗粒细胞培养

2．2．3 颗粒细胞NGF蛋白处理

2．2．4 颗粒细胞NGF蛋白及FSH处理

2．2．5 总RNA提取

2．2．6 总RNA质量和浓度的检测

2．2．7 逆转录

2．2．8 实时荧光定量(参照宝生物说明书)

2．2．9 Elisa检测

2．3 数据分析

3 结果与分析

3．1 不同产蛋阶段绿壳蛋鸡NGF及其受体mRNA组织表达量

3．1．1 等级前卵泡NGF及其受体的表达

3．1．2 等级卵泡NGF及其受体的表达

3．1．3 输卵管NGF及其受体的表达

3．1．4 不同阶段NGF及其受体的表达趋势

3．2 绿壳蛋鸡产蛋期和就巢期NGF及其受体的组织表达差异

3．3 NGF对颗粒细胞的影响

3．3．1 NGF对颗粒细胞TrkA和p75受体基因表达影响

3．2．2 NGF对颗粒细胞激素受体表达影响

3．2．3 NGF对颗粒细胞雌激素和孕激素分泌影响

3．2．4NGF和FSH对颗粒细胞雌激素和孕激素分泌影响

4 讨论

4．1 NGF及其受体在卵巢中的表达

4．2 NGF及其受体在输卵管中的表达

4．3 NGF对产蛋周期的调节

4．4 NGF对颗粒细胞受体基因表达影响

4．5 NGF对颗粒细胞雌激素和孕激素分泌影响

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士研究生期间发表的论文和专利