抑制谷氨酰胺代谢对顺铂或依托泊苷诱导肿瘤细胞凋亡的影响及其机理

摘要

谷氨酰胺代谢在多种肿瘤中都出现了异常升高，它可以为肿瘤细胞生长提供能量、稳定的氧化还原环境和大分子物质合成底物，同时也为治疗肿瘤提供了一种途径。体内外的实验研究表明，通过多种途径抑制谷氨酰胺代谢可有效抑制肿瘤细胞生长。但在肿瘤细胞的研究中，通常需要使用两种或多种药物。明确谷氨酰胺代谢抑制对常规化疗药物在肿瘤治疗作用中的影响具有重要意义。然而，关于谷氨酰胺代谢抑制对常规化疗药物作用的影响及其机理研究尚不多见。细胞凋亡是肿瘤化疗治疗的主要机制。本试验以流式细胞术、蛋白印迹和荧光共聚焦等方法，研究谷氨酰胺缺失以及谷氨酰胺酶抑制剂联合顺铂或依托泊苷引起神经母细胞瘤细胞和乳腺癌细胞凋亡的作用及其机制，为研究谷氨酰胺代谢抑制在肿瘤药物治疗中的作用提供理论依据。
　　试验一抑制谷氨酰胺代谢对顺铂或依托泊苷引起的神经母细胞瘤细胞和乳腺癌细胞凋亡的影响
　　1.抑制谷氨酰胺代谢对顺铂或依托泊苷引起的乳腺癌细胞凋亡的影响
　　试验使用BT-549、HCC1937和HCC38细胞分别在不含谷氨酰胺的培养基或使用BPTES预处理24小时或6小时，然后使用顺铂或依托泊苷作用48小时，检测细胞凋亡。结果显示，顺铂和依托泊苷可刺激细胞cleaved-PARP和cleaved-caspase3的表达。谷氨酰胺缺失或BPTES预处理可促进顺铂或依托泊苷诱导的HCC1937细胞凋亡，也可提高依托泊苷(5μM)诱导的BT-549细胞凋亡，但是对顺铂或依托泊苷诱导的HCC38细胞未产生明显影响，对低浓度的依托泊苷(1μM)诱导的BT-549细胞凋亡或高浓度的顺铂(10μM)诱导的HCC1937细胞凋亡有抑制作用，显示出剂量特异性。
　　2.抑制谷氨酰胺代谢对顺铂或依托泊苷引起的神经母细胞瘤细胞凋亡的影响
　　试验采用谷氨酰胺酶Ⅰ抑制剂BPTES和968或谷氨酰胺缺失的培养基处理细胞6小时或24小时，然后使用顺铂或依托泊苷作用于TET21N、SK-N-BE(2)和SK-N-AS细胞24小时。检测细胞凋亡蛋白caspase-3活性和cleaved-PARP表达，结果显示，抑制剂和药物联合作用对细胞凋亡产生了拮抗作用，谷氨酰胺缺失未对顺铂或依托泊苷引起的SK-N-BE(2)和SK-N-AS细胞caspase-3活性产生明显的影响，但是极显著提高了顺铂而极显著降低了依托泊苷诱导的TET21N细胞caspase-3活性和cleaved-PARP表达，且无剂量特异性。
　　试验二谷氨酰胺缺失对顺铂或依托泊苷诱导的TET21N细胞凋亡的影响
　　1.谷氨酰胺缺失联合顺铂或依托泊苷对TET21N细胞凋亡的影响
　　试验采用谷氨酰胺缺失的培养基处理TET21N细胞24小时，然后使用顺铂或依托泊苷作用24小时。Caspase-3活性和cleaved-caspase9、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、p-γH2Ax、p53、caspase-8、Bid、FLIP-S的表达以及cytochrome c的释放结果显示，由顺铂刺激的TET21N细胞凋亡显著增加，但依托泊苷刺激产生的凋亡却显著降低，且不依赖于NMYC的表达。结果表明，谷氨酰胺缺失对顺铂或依托泊苷的作用同时涉及内源性和caspase-8介导的细胞凋亡途径。
　　2.谷氨酰胺缺失对依托泊苷和顺铂的作用具有时间依赖性
　　试验采用TET21NMYC+细胞在谷氨酰胺缺失的培养基中预处理24小时，然后使用顺铂或依托泊苷作用6小时、10小时、14小时和18小时，检测细胞cleaved-PARP表达和caspase-3活性。结果显示，谷氨酰胺缺失对依托泊苷的凋亡诱导作用呈现先促进后抑制的趋势，而对顺铂的凋亡促进作用则随时间逐渐增加。
　　试验三谷氨酰胺缺失联合顺铂或依托泊苷促进或抑制TET21N细胞凋亡的机制
　　1.谷氨酰胺缺失联合顺铂或依托泊苷对TET21N细胞和线粒体氧呼吸功能的影响
　　采用同试验二第一小节的试验处理方式。通过电极探头检测，发现谷氨酰胺缺失或联合顺铂可显著降低线粒体氧消耗量和细胞钙离子的摄取。谷氨酰胺缺失可降低依托泊苷和顺铂刺激产生的BAX表达，并促进顺铂但抑制依托泊苷引起的Bid(p15)的表达，但对亲环素D的表达不产生明显影响。使用环孢霉素A和米酵菌酸抑制线粒体膜通透性转换孔成分亲环素D和酰胺酸转移酶，发现两种抑制剂仅可轻微减弱顺铂和依托泊苷以及联合谷氨酰胺缺失引起的细胞凋亡。上述结果表明，谷氨酰胺缺失对线粒体呼吸功能和细胞膜钙离子通道都造成了影响，线粒体膜通透性转换孔以及Bid(p15)和BAX共同介导了线粒体膜通透性升高而引起细胞凋亡。
　　2.Caspase、AIF和ROS在谷氨酰胺缺失联合顺铂或依托泊苷引起的TET21N细胞凋亡中的作用
　　采用同试验二第一小节的试验处理方式，同时使用caspase抑制剂ZVAD预处理细胞，发现谷氨酰胺缺失对顺铂的凋亡刺激作用被显著抑制。线粒体AIF的释放结果显示谷氨酰胺缺失可促进AIF的释放，表明AIF和caspase同时介导了细胞凋亡。采用MitoSOX检测线粒体ROS产生，并使用NAC抑制ROS产生。结果发现，谷氨酰胺缺失可引起ROS水平增加，抑制ROS产生可以完全抑制谷氨酰胺缺失联合顺铂引起的细胞凋亡和DNA损伤，但不能完全消除谷氨酰胺缺失对依托泊苷的凋亡抑制作用，表明谷氨酰胺缺失主要是通过促进ROS产生来增加顺铂的凋亡诱导作用，ROS的产生是引起DNA损伤的上游信号。
　　结论:谷氨酰胺代谢抑制促进了顺铂或依托泊苷诱导的HCC1937细胞凋亡，并显示出剂量特异性，对BT-549和HCC38细胞未产生显著影响。谷氨酰胺酶抑制剂与顺铂或依托泊苷联合作用对神经母细胞瘤细胞凋亡产生了拮抗作用。谷氨酰胺缺失可促进顺铂但抑制依托泊苷诱导的TET21N细胞凋亡，且不依赖于NMYC的表达。谷氨酰胺缺失对顺铂或依托泊苷的作用涉及内源性、caspase-8和AIF介导的细胞凋亡途径。谷氨酰胺的缺失主要通过刺激ROS产生而引起DNA损伤，进而增加顺铂的细胞毒性。本试验首次采用谷氨酰胺代谢抑制联合顺铂或依托泊苷作用于神经母细胞瘤细胞和乳腺癌细胞米研究细胞凋亡及机制，为肿瘤联合用药研究提供了理论基础，也为研究谷氨酰胺代谢抑制在肿瘤药物治疗中的作用提供了理论参考。

目录

声明

论文说明

摘要

缩写词表(Abbreviations)

第一章 文献综述

1．细胞凋亡与肿瘤

1．1 细胞凋亡机制

1．2 活性氧自由基在细胞凋亡中的作用

1．3 细胞凋亡与肿瘤

2．谷氨酰胺代谢在肿瘤治疗中的研究

2．1 谷氨酰胺代谢概述

2．2 谷氨酰胺代谢在肿瘤细胞中的变化

2．3 肿瘤细胞中的谷氨酰胺代谢调节

2．4 谷氨酰胺代谢在肿瘤治疗中的研究

3．依托泊苷(Etoposide)的抗肿瘤机理及其耐药性

4．顺铂(Cisplatin)的抗肿瘤机理及其耐药性

5．神经母细胞瘤细胞和乳腺癌细胞的研究介绍

5．1 神经母细胞瘤细胞简介

5．2 乳腺癌细胞简介

第二章 立题依据、研究目的和技术路线

1．立题依据

2．研究目的

3．研究内容

4．技术路线

第三章 抑制谷氨酰胺代谢对顺铂或依托泊苷引起的神经母细胞瘤细胞和乳腺癌细胞凋亡的影响

1．引言

2．材料和方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．3 数据处理

3．结果

3．1 谷氨酰胺缺失、顺铂和依托泊苷对乳腺癌细胞增殖的影响

3．2 谷氨酰胺缺失对顺铂或依托泊苷引起乳腺癌细胞凋亡的影响

3．3 谷氨酰胺缺失联合顺铂或依托泊苷对神经母细胞瘤细胞凋亡蛋白表达的影响

3．4 BPTES联合顺铂或依托泊苷对乳腺癌细胞凋亡的影响

3．5 谷氨酰胺酶Ⅰ抑制剂联合顺铂或依托泊苷对神经母细胞瘤细胞凋亡蛋白表达的影响

4．讨论

5．小结

第四章 谷氨酰胺缺失对顺铂或依托泊苷诱导的TET21N细胞凋亡的影响

1．引言

2．材料和方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．3 数据处理

3．结果

3．1 谷氨酰胺缺失引起TET21N细胞LDH活性变化

3．2 谷氨酰胺缺失促进顺铂但抑制依托泊苷引起的TET21NMYC+细胞凋亡

3．3 谷氨酰胺缺失联合顺铂或依托泊苷对TET21N细胞的凋亡作用不依赖于NMYC的表达

3．4 谷氨酰胺缺失联合顺铂或依托泊苷对TET21N细胞产生的凋亡效应涉及外源性凋亡途径

3．5 谷氨酰胺缺失联合顺铂或依托泊苷对TET21N细胞的DNA损伤作用

3．6 谷氨酰胺缺失对顺铂或依托泊苷的作用具有时间依赖性

4．讨论

5．小结

第五章 谷氨酰胺缺失联合顺铂或依托泊苷促进或抑制TET21N细胞凋亡的机制

1．引言

2．材料和方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．3 数据处理

3．结果

3．1 谷氨酰胺缺失对TET21NMYC+细胞膜和线粒体的影响

3．2 谷氨酰胺缺失对TET21NMYC+细胞线粒体膜通透性的影响

3．3 Caspase在TET21NMYC+细胞凋亡中的作用

3．4 AIF参与谷氨酰胺缺失引起的TET21N细胞凋亡

3．5 谷氨酰胺缺失对TET21NMYC+细胞氧化还原平衡的影响

3．6 线粒体ROS的产生在TET21NMYC+细胞凋亡中的作用

3．7 线粒体ROS的产生在TET21N细胞DNA损伤中的作用

3．8 Akt和亲环素A在TET21NMYC+细胞凋亡中的作用

4．讨论

5．小结

第六章 结论及创新

1．结论

2．创新点

3．有待进一步研究的问题

参考文献

附图

致谢

攻读学位期间获得学术成果