鲟源海豚链球菌的分离鉴定及荚膜多糖基因的进化分析

摘要

2013年8-9月，四川雅安汉源湖养殖的西伯利亚鲟发生一种以体表溃疡、内脏出血和心外膜囊肿为特征的传染病。为明确其病因，本研究从自然发病鱼的肝、脾和肾进行涂片检查和病原菌的分离、人工感染、分离菌的表型特征和分子生物学特征的检测。肝脏和脾脏涂片均观察到大量的革兰氏阳性球菌，从患病鱼体内分离到一株优势菌，革兰氏染色呈G+链状球菌(Ab130920)。人工感染实验证实分离株能够引起试验鱼高死亡率，明确了其病原性。生理生化特性检测，除对精氨酸和乳糖反应外，与海豚链球菌（Streptococcus iniae，S.iniae）(ATCC29178)基本一致;16S rDNA序列(GenBank登录号:KJ162337)与GenBank中S.iniae16SrDNA序列同源性最高，在以16SrDNA序列及其GenBank中同源性较高的相关序列构建的系统发育树上，分离菌与S.iniae聚为一族;同时，在基于S.iniae乳酸氧化酶基因的特异性PCR检测中，从分离株基因组DNA扩增出预期大小的870 bp条带，综合表型特征和分子学特征检测结果，进而鉴定分离菌Ab130920为S.iniae。药物敏感性检测发现其对阿莫西林、强力霉素、氟苯尼考等抗菌药物敏感，但对新生霉素、利福平、氧氟沙星耐药。
　　为研究其毒力，本试验进行了血清杀菌实验、血清学分型、对EPC细胞的粘附和侵染实验、毒力基因检测和自然发病鱼的病理学损伤研究。结果表明，菌株在健康西伯利亚鲟的血清中存活率为66.2％，说明血清仅能够杀死部分细菌，存活细菌可能随着血液循环引起全身性的感染;通过对精氨酸和乳糖反应以及随机扩增多态性DNA标记分析，证实Ab130920为血清学Ⅱ型;其对EPC细胞的粘附率为3.28％，侵入率为0.08％，证明菌株可粘附在宿主细胞表面进而进入细胞内定殖;在对cpsD、simA、sagA、pdi和scpI等5种S.iniae毒力基因的多重PCR检测中，分离菌均扩增出相应大小的特异性片段，表明其为一毒力较强的菌株，与人工感染实验的高致病性结果相佐证;组织病理学表明，Ab130920引起西伯利亚鲟全身性感染，导致多个组织器官的出血、细胞变性和坏死，尤其是肝、肾、脾、心和肌肉的严重损伤，表现为坏死性肝炎、肝血管炎、肾小球肾炎、间质性肾炎、急性脾炎、心肌炎、桑葚心和骨骼肌的坏死性肌炎;另外鳃、胃肠道、脑和胰腺也出现不同程度的损伤，表现鳃小片炎、胃炎、肠炎、脑膜炎和胰腺广泛性出血。
　　为研究其荚膜多糖基因的进化关系，对菌株Ab130920和标准菌株ATCC29178的荚膜多糖基因进行PCR扩增，并克隆测序，获得其序列，并与相关文献和GenBank中荚膜多糖基因进行多序列比对，明确荚膜多糖基因的变异性，分析其碱基突变引起相应氨基酸的改变。选择变异性较大的基因cpsD，与相关文献和GenBank中的荚膜多糖基因序列进行贝叶斯进化分析。结果表明，S.iniae荚膜多糖基因存在变异的有cpsY、 cpsC、cpsD、cpsE、cpsG和cpsY基因，特别是cpsD和cpsE;变异基因在相应位点发生插入、缺失或移码突变，引起相应氨基酸改变;选择cpsD基因进行贝叶斯进化分析，发现分离的鲟源S.iniae Ab130920变异程度高。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 鲟鱼的养殖与病害

1．1 鲟鱼的生物学特性及养殖状况

1．2 鲟鱼的主要疾病

2 S.iniae研究进展

2．1 S.iniae的分类及生物学特性

2．2 S.iniae的感染及症状

2．3 S.iniae致病机制及毒力因子

2．4 防治

3 实验目的及意义

第二章 鲟源S.iniae的分离鉴定

1 材料

1．1 试验菌株及试验动物

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂

2 方法

2．1 病原检测

2．2 人工感染

2．3 菌株鉴定

2．4 药物敏感性试验

3 结果

3．1 剖解及临床症状观察

3．2 病原检测结果

3．3 人工感染

3．4 菌株鉴定

3．5 分子学鉴定

3．6 药物敏感性试验

4 讨论

4．1 S.iniae感染现状

4．2 S.iniae的鉴定

4．3 S.iniae的药物敏感性

第三章 分离株的毒力研究

1 材料

1．1 试验菌株和试验动物

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂

2 方法

2．1 血清杀菌实验

2．2 菌株对EPC细胞的粘附与侵染

2．3 菌株血清型分型

2．4 菌株主要毒力基因检测

2．5 自然感染西伯利亚鲟的病理损伤研究

3 结果

3．1 血清杀菌实验

3．2 菌株对EPC细胞的粘附和入侵

3．3 血清学分型

3．4 菌株主要毒力基因检测

3．5 自然感染S.iniae西伯利亚鲟病理学损伤

4 讨论

4．1 S.iniae的血清学分型

4．2 S.iniae的毒力因子

4．3 组织病理学损伤

第四章 基于S.iniae荚膜多糖基因的进化分析

1 试验材料

1．1 试验菌株／载体

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2 试验方法

2．1 引物设计与合成

2．2 S.iniae荚膜多糖cps基因的PCR扩增

2．3 荚膜多糖基因的T载体克隆

2．4 S.iniae cps基因多样性分析

2．5 cpsD基因的贝叶斯进化分析

3 结果

3．1 荚膜多糖cps基因PCR扩增

3．2 cps基因多样性分析

3．3 荚膜多糖基因突变及其编码氨基酸变异分析

3．4 基于cpsD基因贝叶斯进化分析

4 讨论

4．1 S.iniae cps基因多样性

4．2 cpsD基因的进化分析

5 结论

参考文献

作者攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢