LKB1/AMPK信号通路相关基因在家兔肠炎模型中的表达差异研究

摘要

LKB1/AMPK信号通路广泛参与机体细胞的增殖、分化和凋亡等生理活动，调控能量代谢等生命活动。而LKB1基因作为AMPK上游关键基因之一，其突变或者失活会引起AMPK信号通路变化，由此导致人类胃肠道疾病发生。因此，本试验旨在研究LKB1/AMPK信号通路内信号因子在家兔非特异性肠炎中的表达差异和作用机制，从而为家兔非特异性肠炎治疗和预防提供理论依据。试验前期克隆LKB1基因并通过构建低纤维日粮诱导家兔非特异性肠炎模型，采用RT-qPCR法检测LKB1、AMPK(PRKAA2)、mTOR和NF-κβ基因在健康正常组（30只）和低纤维诱导肠炎组（60只）中7个组织（十二指肠、圆小囊、空肠、回肠、结肠、肝脏和脾脏）的mRNA表达量。试验后期通过培养家兔结肠上皮细胞(CEC)以及利用LPS构建家兔CEC炎症模型，采用RNAi技术干扰炎症细胞中LKB1基因的表达，然后通过RT-qPCR法检测LKB1、PRKAA2、NUAK1、mTOR、NF-κβ、IL-1A、TNF-α、PGC-1α和ATG13基因在不同炎症细胞组中mRNA表达量，由此分析LKB1/AMPK信号通路在家兔非特异性肠炎中的作用机制。主要结果如下:
　　1、克隆得到家兔LKB1基因的CDS全序列（GenBank登录号为KT439400）。CDS区全长分别为1317 bp，编码氨基酸数为438。家兔LKB1基因核苷酸序列与人、鼠兔和沟鼠同源基因序列一致性分别为87.85％、89.98％和85.42％，表明LKB1基因在物种间进化高度保守。
　　2、检测LKB1、AMPK、mTOR和NF-κβ基因在家兔低纤维日粮诱导非特异性肠炎模型中7个不同组织样本中的表达差异，结果表明在肠炎组的肝脏组织中LKB1表达量升高，其中mTOR基因表达量极显著升高，并与炎症因子NF-κβ呈负相关。在肠炎组的小肠的三个组织中LKB1、PRKAA2、NF-κβ与mTOR呈负相关，其中在十二指肠中LKB1基因表达与NF-κβ表达呈正相关，mTOR极显著升高，并与NF-κβ表达呈负相关。而在肠炎组免疫组织（圆小囊和脾脏）中LKB1、PRKAA2、mTOR均与炎症因子NF-κβ表达呈负相关。
　　3、复苏和培养已分离纯化的CEC细胞后，当添加LPS终浓度为1000ng/ml时，成功构建了家兔结肠炎症细胞(CEC)炎症模型。
　　4、利用RNAi技术干扰炎症CEC中LKB1基因的表达，成功筛选出能够沉默LKB1基因表达的si-02-LKB1，沉默效率达90.7％。
　　5、检测炎症细胞组模型（转染si-02-LKB1炎症细胞组和未转染siRNA炎症细胞组）中LKB1/AMPK信号通路相关信号因子的表达差异，结果表明干扰LKB1基因表达后，引起AMPK信号通路下游基因AMPK(PRKAA2)、mTOR、PGC-1α和ATG13表达量在不同时段升高，而AMPK(NUAK1)、IL-1A和TNF-α下降。由此表明LKB1基因通过AMPK信号通路相关信号因子影响炎症因子表达。
　　本试验通过克隆家兔LKB1基因和研究LKB1/AMPK信号通路下游基因对家兔非特异性肠炎的影响，结果表明LKB1基因通过AMPK信号通路对家兔肠炎起调节作用，LKB1表达量降低会缓解家兔非特异性肠炎的炎症反应，可作为影响家兔肠炎发病的重要候选基因，以此为家兔抗病育种提供理论依据。

目录

论文说明

声明

摘要

学术名词简表

1 文献综述

1．1 肠炎发生分子机制研究

1．2 LKB1基因的发现及其分子结构

1．3 LKB1基因的调节方式

1．4 LKB1基因功能

1．4．1 对T细胞发育影响

1．4．2 促进成肌细胞分化

1．4．3 可变剪切体LKB1s与精细胞形成

1．4．4 LKB1对细胞极性调节

1．4．5 LKB1与癌症发生关系

1．5 LKB1基因相关信号通路

1．5．1 LKB1／AMPK信号通路与能量代谢

1．5．2 AMPK／SIRT1／NF-κβ信号通路介导炎症反应

1．5．3 LKB1／AMPK／mTOR信号通路与癌症发生

1．6 RNAi技术的应用

1．6．1 RNAi的发现

1．6．2 RNAi的作用机制

1．7 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 仪器与试剂

2．3 试验方法

2．3．1 各组织总RNA的提取

2．3．2 总RNA质量检测

2．3．3 反转录合成cDNA

2．3．4 克隆LKB1基因

2．3．5 组织定量表达分析

2．4 细胞试验

2．4．1 细胞传代

2．4．2 冷冻和复苏细胞

2．4．3 细胞计数

2．4．4 siRNA序列及相关基因引物信息

2．4．5 筛选siRNA及检测炎症细胞中各基因表达水平

3 试验结果

3．1 LKB1基因克隆及序列分析

3．1．1 RNA质量检测

3．1．2 LKB1基因克隆结果

3．1．3 测序及生物信息学分析结果

3．2 检测肠炎模型组各组织基因表达

3．3 细胞试验结果

3．3．1 CEC细胞培养及观察

3．3．2 细胞生长曲线

3．3．3 构建细胞炎症模型

3．4 筛选干扰siRNA序列

3．4．1 细胞总RNA提取及反转录

3．4．2 转染及筛选siRNA

3．5 转染si-02-LKB1对AMPK信号通路相关基因表达影响

3．5．1 LKB1／AMPK信号通路下游相关基因表达结果

3．5．2 炎症细胞中PGC-1α和 ATG13表达结果

3．6 炎症细胞中促炎因子IL-1A和TNF-a表达结果

4 讨论

4．1 克隆及生物信息学分析

4．2 肠炎模型组各组织表达分析

4．2．1 LKB1组织表达分析

4．2．2 与LKB1相关基因的组织表达分析

4．3 转染si-02-LKB1对炎症细胞模型中信号因子表达影响

4．4．1 PGC-1α和ATG13表达差异分析

4．4．2 AMPK激酶及其相关信号因子表达差异分析

4．4．3 促炎因子IL-14和TNF-α表达差异分析

5 结论

参考文献

致谢