猪源抗菌肽Cecropin P1的原核表达及抑菌活性检测

摘要

随着抗生素的使用，药物残留和菌株耐药性等问题日益严重，寻找抗生素替代品已迫在眉睫。抗菌肽以其独特的抗菌机制及不易产生耐药性等优点，在替代传统抗生素、减少菌株耐药性等方面显示出广阔的应用前景。天蚕素(Cecropins)是首先由Huhmark等人在惜古比天蚕中发现的抗菌肽，目前已有30多种天蚕素被报道，其中Cecropin P1(CP1)是Lee等首先从猪小肠分离得到的抗菌肽，由31个氨基酸组成，分子量为3339 Da，具有广谱抗菌活性。但由于CP1的天然产量有限，分离纯化困难且成本较高，极大限制了它的临床应用，因此通过基因工程技术生产CP1具有重要的意义。
　　为探索大量获取CP1的基因工程方法。本研究根据CP1成熟肽的氨基酸序列，利用大肠杆菌密码子偏爱性特点，采用搭桥PCR技术，设计合成CP1目的基因，并构建重组克隆质粒pMD19-T-CP1。利用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ分别对原核表达载体pCold TF和重组克隆质粒pMD19-T-CP1双酶切，并在T4 DNA连接酶的作用下构建重组表达质粒pCold TF-CP1。将pCold TF-CP1转化BL21(DE3)感受态细胞，所得阳性转化菌株（重组质粒工程菌）经IPTG诱导表达融合蛋白(rCP1)。rCP1经Ni-NTA柱纯化及超滤除盐浓缩后，由肠激酶切割释放CP1。最后采用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法对CP1抑菌活性进行检测。主要研究结果如下：
　　(1)通过搭桥PCR技术成功合成CP1目的基因，并构建了重组克隆质粒pMD19-T-CP1。
　　(2)成功构建了重组表达质粒pCold TF-CP1，并转化BL21(DE3)感受态细胞得到重组质粒工程菌。
　　(3)重组质粒工程菌经IPTG诱导表达出可溶性融合蛋白，其占总可溶性蛋白的36％以上;融合蛋白经Ni-NTA柱纯化后纯度约为80％;通过超微量分光光度计(NANODROP2000)测定超滤后的浓缩蛋白浓度为3.5 mg/mL;经计算每升菌体培养物可获得约55 mg融合蛋白。
　　(4)通过与标准品比较，确定2.8 mg/mL rCP1经肠激酶切割释放出（0.14±0.04） mg/mL CP1。抗菌试验结果表明，CP1对肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和沙门氏菌有良好的抗菌活性。
　　本研究利用原核表达系统成功获得了rCP1，rCP1经肠激酶切割后释放出具有良好抗肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和沙门氏菌活性的CP1，为建立基因工程菌规模化生产抗菌肽相关研究奠定了基础和提供了科学参考。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 文献综述

1 抗菌肽的研究进展

1．1 抗菌肽的概述

2 猪源抗菌肽Cecropin P1

2．1 Cecropin P1的结构

2．2 Cecropin P1的抗菌机理

第二部分 试验研究

第一章 抗菌肽Cecropin P1目的基因的人工合成

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

第二章 重组表达质粒pCold TF-CP1的构建

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

第三章 重组质粒工程菌的诱导表达

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

第四章 抗菌肽CP1的释放及抑菌活性检测

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文