内质网应激通过PI3K-Akt-mTOR通路调控鹅原代肝细胞脂质代谢的研究

摘要

内质网应激能够诱导啮齿类动物和人类肝脂肪变性模型已经被报道，同时最近研究显示内质网应激在肝脂肪沉积中起重要调控作用。内质网应激激活脂肪合成的转录因子SREBP-1C水解导致脂肪合成酶的诱导表达。内质网应激与通过抑制ApoB100分泌导致VLDL的分泌受损有关联。但PI3K-Akt-mTOR信号通路通过内质网应激调控脂质代谢的作用鲜有研究。本实验通过PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂LY294002、NVP-BEZ235、Rapamycin处理鹅肝细胞后用衣霉素诱导内质网应激，采用荧光定量PCR法检测基因定量，western blotting蛋白检测法，Elisa试剂盒检测法以及油红O染色法检测脂肪酸合成，脂肪酸氧化及脂质转运途径的相关指标来反映脂质代谢的变化，分析内质网应激对肝脏腊质代谢的作用以及PI3K-Akt-mTOR信号通路的介导作用，为探讨PI3K-Akt-mTOR信号通路与内质网应激在肝脏内脂质代谢作用的分子机制及其基因水平的调控提供理论依据，我们得到的研究结果如下:
　　1.相比空白对照组用0.2μmol/L、2μmol/L、20μmol/L衣霉素处理细胞24小时，内质网应激相关基因BIP、EIF2a、ATF6、XBP1表达水平显著升高(P＜0.05)，内质网应激关键蛋白BIP/GRP78蛋白浓度显著升高(P＜0.05)，表明在鹅肝细胞衣霉素诱导内质网应激成功。
　　2.衣霉素处理细胞引起mTORc1的mRNA的表达显著降低，PI3K和S6K的mRNA表达增加(P＜0.05)，对Akt1基因的mRNA表达则没有显著影响。同时PI3K、mTOR、S6K酶的活性，与对照组相比，mTOR的蛋白表达含量降低，而PI3K和S6K蛋白活性增加，表明衣霉素诱导的内质网应激可以调控PI3K和mTORc1基因。
　　3.用LY294002、NVP-BEZ235、Rapamycin处理鹅肝细胞降低衣霉素诱导的内质网应激相关基因BIP、EIF2a、ATF6、XBP1的升高(P＜0.05)，降低内质网应激关键蛋白BIP/GRP78的蛋白浓度的升高(P＜0.05)，NVP-BEZ235、Rapamycin的抑制作用显著高于LY294002的作用(P＜0.05)，NVP-BEZ235和Rapamycin之间差异不显著，表明抑制剂LY294002、NVP-BEZ235、Rapamycin能抑制衣霉素诱导的内质网应激。
　　4.衣霉素处理细胞引起细胞内TG含量显著增加，细胞内VLDL含量减少，油红O染色显示细胞内脂滴颗粒增多，脂质沉积明显;基因FAS、ACCα、 PPARγ、PPARα、CPT1、MTP、ApoB、DGAT1、DGAT2的mRNA表达量比对照组显著减少，SREBP-1表达量增加(P＜0.05)，其中，ACOX1基因mRNA表达量与对照组无明显差异;酶活显示相比对照组衣霉素处理细胞后FAS、CPT、MTP蛋白浓度降低(P＜0.05)，ACC蛋白浓度无明显差异;western blotting结果表明衣霉素抑制CPT1蛋白的蛋白表达。这些结果表明，鹅肝细胞中内质网应激能通过调节细胞内脂肪酸合成，脂肪酸氧化以及脂质转运相关基因的表达参与细胞脂质代谢。
　　5.与单独衣霉素处理相比，LY294002、NVP-BEZ235、Rapamycin分别和衣霉素共同处理细胞后，细胞内的TG含量降低，胞外TG含量差异不显著，胞内VLDL含量增加，油红O染色显示细胞内脂滴颗粒明显减少;基因ACCα、FAS、SREBP-1、CPT1、ACOX1、MTP、ApoB、PPARγ和DGAT2的mRNA表达量降低，PPARα、DGAT1表达量增加; CPT1、MTP蛋白浓度升高，ACC蛋白浓度降低(P＜0.05)，FAS蛋白浓度差异不显著;westem blotting结果表明CPT1蛋白表达降低;以上结果表明当通路被抑制时，能有效缓解内质网应激对脂质代谢过程的影响。

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论文说明

声明

摘要

常用词语英文缩写

1．文献综述

1．1 内质网应激的信号通路

1．1．1 ATF6途径

1．1．2 IRE1／XBP1途径

1．1．3 PERK／eIF2a途径

1．2 衣霉素与内质网应激

1．2．1 蛋白质的糖基化

1．2．2 衣霉素与内质网应激

1．3 内质网应激与脂质代谢的关系

1．3．1 内质网应激直接激活SREBPs

1．3．2 IRE1与脂质代谢

1．3．3 ATF6与脂质代谢

1．3．4 PERK与脂质代谢

1．3．5 内质网应激反应通过影响ApoB调节脂类的分泌

1．4 PI3K-Akt-mTOR信号途径与脂质代谢的关系

1．5 PI3K-Akt-mTOR信号途径与内质网应激的相互作用

1．6 本研究的目的及意义

2．材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验样品

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要药品和试剂

2．2 试验方法

2．2．1 引物设计及合成

2．2．2 细胞培养

2．2．3 LY294002、NVP-BEZ235、Rapamycin和TM处理细胞

2．2．4 CCK-8检测细胞活性

2．2．5 脂滴油红O染色

2．2．6 总RNA提取及质量检测

2．2．7 反转录反应

2．2．8 荧光定量PCR

2．2．9 蛋白质抽提

2．2．10 酶活检测

2．2．11 Western blot

2．2．12 数据分析

3．结果与分析

3．1 内质网应激对脂质代谢的影响研究

3．1．1 内质网应激激活剂的筛选

3．1．2 内质网应激激活剂对脂质代谢的影响

3．2 PI3K-Akt-mTOR信号途径和内质网应激的相互影响

3．2．1 内质网应激对PI3K-Akt-mTOR信号途径的影响

3．2．2 PI3K-Akt-mTOR信号途径抑制剂对内质网应激的影响

3．2．3 PI3K-Akt-mTOR信号途径抑制剂与衣霉素共同处理对内质网应激的影响

3．3 PI3K-Akt-mTOR信号途径与内质网应激共同调节脂质代谢的研究

3．3．1 脂肪酸合成的影响

3．3．2 脂肪酸氧化的影响

3．3．3 脂质转运的影响

4．讨论

4．1 内质网应激与PI3K-Akt-mTOR信号途径的关系

4．1．1 PI3K-Akt对内质网应激的影响

4．1．2 mTOR对内质网应激的影响

4．1．3 内质网应激对PI3K-Akt-mTOR信号通路的影响

4．2 内质网应激对脂质代谢的调控

4．2．1 内质网应激对脂质合成的调控

4．2．2 内质网应激对脂质氧化的调控

4．2．3 内质网应激对脂质转运的调控

4．3 内质网应激通过PI3K-AM-mTOR信号途径对脂质代谢的调控

4．3．1 内质网应激通过PI3K-Akt-mTOR途径调控脂质合成和氧化

4．3．2 内质网应激通过PI3K-Akt-mTOR信号途径对脂质转运的调控

5．结论

参考文献

致谢

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