抑制素A在蛋鸡生殖系统中的表达及对颗粒细胞发育的影响

摘要

抑制素作为调节下丘脑-垂体-性腺轴系的一员，已有研究证明抑制素的表达形式和水平与卵泡发育募集、选择、优势化等生理活动有关。因此，通过研究抑制素A及其对家禽繁殖性能的调控作用具有重要的理论和实践意义。本试验以蛋鸡为对象，研究抑制素A的INHA、INHBA亚基在鸡生殖系统及不同时期卵泡中的表达差异;INHA基因多态性及遗传效应分析;外源添加的抑制素A蛋白对颗粒细胞发育的影响。探索抑制素A对卵泡选择与优势化、卵泡成熟过程所起的关键性的作用，以期阐明抑制素A对各激素的调控以及颗粒细胞增殖、凋亡作用机制。获得的主要结果如下:
　　(1)荧光定量PCR分析INHA、INHBA的mRNA在鸡生殖系统不同组织中的表达水平，结果发现INHA、INHBA主要在卵巢的不同等级卵泡中表达，INHBA在输卵管中的表达量较低。卵泡发育从LWF到F1，INHA的表达量呈现先上升后下降的趋势，F5卵泡中的表达量显著高于其他卵泡(P＜0.05)。在等级前卵泡中，SYF中的表达量显著高于LWF（P＜0.05），在SWF卵泡中并未检测到。INHBA在F1中的表达量显著高于其他等级卵泡（P＜0.05）。随后利用western blot分析INHA、INHBA蛋白在鸡不同时期卵泡中的表达水平，结果发现:INHA在卵泡中的蛋白表达水平与mRNA类似，INHA蛋白在F5和SYF中的表达量较高，在F5中的表达量显著高于其他等级卵泡(P＜0.05)。INHBA蛋白的表达量在F1中最高(P＜0.05)。表明INHA、INHBA的表达量可能与卵泡发育相关，推测抑制素A可能参与调节鸡卵泡的发育。
　　(2)利用抑制素A重组蛋白处理鸡卵泡颗粒细胞，结果发现，抑制素A可以提高鸡卵泡颗粒细胞的活性，并且呈剂量依赖效应，添加100ng/mL和200ng/mL浓度蛋白的试验组与空白对照组相比，颗粒细胞数目显著增加(P＜0.05)，高浓度重组蛋白(200ng/mL)显著抑制鸡颗粒细胞Bax、Caspase-3基因的表达（P＜0.05）;对Bcl-2和PCNA基因的表达则有促进作用。提示抑制素A蛋白在体外能够促进鸡颗粒细胞的增殖。不同浓度/时间的抑制素A蛋白处理体外培养的鸡颗粒细胞，结果发现，高浓度抑制素A可促进雌二醇的分泌（P＜0.05）;（100、200ng/mL）浓度抑制素A促进孕酮的分泌（P＜0.05），10ng/mL处理颗粒细胞24h对孕酮分泌影响不明显。
　　(3)利用实时荧光定量检测对孕酮合成关键基因STAR、3β-HSD表达的影响，结果发现，抑制素A浓度梯度蛋白使STAR和3β-HSD基因的表达升高。200ng/mL处理(24-48h)细胞STAR和3β-HSD基因的mRNA表达量显著增加(P＜0.05)。说明抑制素A可以促进颗粒细胞分泌孕酮和雌二醇。对颗粒细胞FSH、LH激素受体基因FSHR和LHR表达的影响，结果表明，对照组（0ng/mL）随着培养时间的增加，颗粒细胞FSHR的mRNA表达量呈现先上升后下降再上升的趋势，而高浓度的抑制素A(200ng/mL)在各个时间点都抑制了FSHR的表达;抑制素A（200ng/mL）处理(48-72h)颗粒细胞可显著增加LHR的mRNA表达量(P＜0.05）。推测外源抑制素A能够促进鸡卵泡颗粒细胞雌二醇、孕酮的合成;高浓度的抑制素A可以显著抑制FSHR的表达，增加LHR的表达量。
　　(4)通过对INHA基因的SNPs进行筛选并与产蛋性状关联性分析。测序结果共发现了12个突变位点，其中SNP1、SNP2、SNP3属于同义突变;SNP5、SNP6、SNP7属于错义突变;单个位点与蛋鸡繁殖性状的关联性分析，结果发现:SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP12与300日龄产蛋量的遗传效应达到显著水平(P＜0.05)。
　　综上所述，抑制素A参与调节鸡卵泡的发育，INHA在卵泡募集过程中发挥着重要作用，而INHBA可能对卵泡成熟起着关键作用。此外，抑制素A对卵泡颗粒细胞增殖及雌二醇、孕酮的合成也有不同程度的调控作用。INHA基因可作为鸡产蛋性能选择的分子标记。

目录

论文说明

声明

摘要

缩写对照表

1文献综述

1．1抑制素简介

1．1．1抑制素的命名

1．1．2抑制素在动物体内的转录激活及作用机制

1．2抑制素A调节动物的繁殖性能

1．2．1抑制素A调节激素的合成与分泌

1．2．2抑制素A调节卵泡发育

1．3家禽生殖系统结构组成

1．4抑制素A亚基SNP与动物繁殖性能相关分析研究

1．5研究的主要内容及目的意义

1．5．1主要内容

1．5．2目的意义

2材料与方法

2．1试验材料

2．1．1试验动物

2．1．2主要试剂及试剂盒

2．1．3主要仪器设备

2．1．4主要应用的生物学软件

2．2试验方法

2．2．1组织采集及总RNA提取

2．2．2总RNA质量检测

2．2．3鸡卵泡组织总蛋白提取

2．2．4鸡原代颗粒细胞的分离培养及抑制素A蛋白处理

2．2．5细胞活性、细胞增殖检测(CCK-8)

2．2．6 Elisa检测细胞上清孕酮、雌激素含量

2．2．7实时荧光定量

2．2．8 Western blot

2．2．9繁殖性能测定及方法

2．2．10引物设计及合成

2．2．11 PCR扩增体系及参数

2．3数据分析

3结果与分析

3．1．1 INHA、INHBA基因在鸡生殖系统各组织中的表达结果

3．1．2 INHA、INHBA蛋白在鸡的不同等级卵泡中的表达结果

3．2抑制素A蛋白调控颗粒细胞凋亡、增殖及激素分泌的结果

3．2．1不同浓度抑制素A处理鸡卵泡颗粒细胞结果

3．2．2不同时间的蛋白处理对鸡颗粒细胞发育影响的结果

3．3 INHA的SNP筛选及其遗传效应研究结果

3．3．1鸡产蛋性状记录结果

3．3．2 DNA池测序结果

3．3．2 INHA基因的SNP检测结果

3．3．3 INHA基因多态性及遗传效应

4讨论

4．2抑制素A重组蛋白对体外培养的鸡卵泡颗粒细胞发育的影响

4．3INHA基因多态性及遗传效应分析

5结论

参考文献

致谢

附录

作者简历