富钾基因型烤烟筛选及钾积累特性研究

摘要

钾素对于作物的生长具有非常重要的作用，参与了其中各个重要环节。烟草是一种较为典型的喜好钾素的作物，而钾素除了参与其生长代谢之外，还能增强其抗虫抗病能力和抗逆境的能力。此外，钾素含量还影响烟叶的品质，是衡量烟叶品质优劣的重要指标。然而，我国的钾资源匮乏、土壤钾素利用率低等客观因素对提高烟叶含钾量带来极大的困难。
　　本文收集了70份烤烟种质材料，进行连续两年田间试验，筛选富钾基因型烤烟，并在此基础上，研究了富钾基因型烤烟根际土壤特征、根系响应特征和植株生理生化特性，以明确烤烟钾富集生理机制;同时，进行了烤烟移栽后各生育期内钾积累规律研究，通过RNA-seq测序，明确烤烟不同钾积累阶段的相关基因（簇）差异，发掘与钾积累阶段相符合的特征性基因表达量模块。主要研究结果如下:
　　1、9个不同烤烟品种不同生育期各部位烟叶含钾量和钾积累量均呈“双峰”状变化，分别在旺长后期和中部叶成熟期达到钾吸收、积累的高峰，其中下部叶钾的积累峰出现在烟株中部叶成熟期;中、上部烟叶的2个积累峰分别出现在旺长后期及中部叶成熟期，其积累峰出现的具体时间因品种的不同存在一定的差异。烟叶钾素积累的动态特征对于针对性地调整钾肥追施时期、最大化提高烟叶含钾量具有重要的实践意义，经大田验证，在烟叶钾素积累高峰期适时补充钾肥可使烟株各部位烟叶含钾量提高2％以上，效果显著。
　　2、供试70份烤烟品种的烟叶含钾量在基因型间差异显著。两种施钾处理下，嘎吉红大、长叶红大、K326、KRK26四种烤烟材料在连续两年的田间试验中均表现出稳定的富钾特征，既可以直接应用于烟叶生产，亦可为高钾烤烟品种的选育提供优良的后备资源。
　　3、相同施钾水平下，富钾基因型烤烟（KRK26和K326）根际土速效钾和缓效钾含量显著高于低钾基因型烤烟（毕纳1号）。不同施钾处理下，两类基因型烤烟根际土壤速效钾含量均高于非根际土;缓效钾含量则因基因型的不同表现出相反的趋势，富钾基因型烤烟（KRK26和K326）根际土壤缓效钾含量高于非根际土壤，低钾基因型烤烟（毕纳1号）表现为根际土缓效钾含量低于非根际土。随着钾肥施用量的增加，两类基因型根际土与非根际土脲酶、过氧化氢酶活性和土壤pH值逐渐降低，而蔗糖酶活性逐渐升高。在钾肥施用量较低时（75mg kg-1土与150mg kg-1土），低钾基因型烤烟（毕纳1号）根际土脲酶活性、过氧化氢酶活性显著低于富钾基因型烤烟（KRK26和K326）;不同基因型间蔗糖酶活性差异不显著。
　　4、随着供钾水平的增加，低钾基因型烤烟（毕纳1号）根系总吸收面积和活跃吸收面积显著增加，富钾基因型烤烟（KRK26和K326）无显著变化。根系活力随供钾水平的增加而大幅度下降，低钾基因型烤烟（毕纳1号）比富钾基因型烤烟(KRK26和K326)的降幅更大，当供钾浓度为0.02mmol L-1时，根系活力存在着显著的基因型差异。基因型差异和供钾水平对烤烟根系CEC均未产生显著影响。供钾水平是影响烤烟根系H+分泌能力的重要因素，对于富钾基因型烤烟（KRK26和K326），供钾水平越高，根系H+分泌能力越低;对于低钾基因型烤烟（毕纳1号），供钾水平为中等(0.20mmolL-1)时根系H+分泌能力最强;在相同钾水平下，富钾基因型烤烟（KRK26和K326）根系H+分泌能力显著地低于低钾基因型烤烟（毕纳1号）。
　　5、富钾基因型烤烟（KRK26和K326）叶片钾含量在不同施钾水平下均高于低钾基因型烤烟（毕纳1号）。富钾基因型烤烟（KRK26和K326）叶绿素含量在低钾条件下仍保持与正常施钾相当水平，而低钾基因型烤烟（毕纳1号）叶绿素含量显著下降。在旺长期和中部叶成熟期，富钾基因型烤烟（KRK26和K326）SOD活性均高于低钾基因型烤烟（毕纳1号），随着施钾量的降低，SOD活性均显著降低，旺长期烟株SOD活性对低钾更为敏感，低钾基因型烤烟（毕纳1号）较富钾基因型烤烟（KRK26和K326）更为敏感。在旺长期和中部叶成熟期，两种基因型NR活性均表现为随着施钾量下降而显著降低;而INV活性随施钾量升高而显著升高。
　　6、通过对川烟1号和Coker176的RNA测序，发现不同钾积累阶段样品检测原始片段(Raw reads)均在14801735(4.4Gb)以上，测序效果良好，以Ⅳtabacum K326为参考基因组进行组装和基因预测，检测到不同钾积累阶的已知基因数目数为49255，占参考基因组的基因总数的比率为97.14％;检测到1362个新基因。对川烟1号和Coker176进行5个钾积累阶段的WGCNA分析，最终得到基因共表达程度高的22个模块，进一步与烟草钾积累表型进行关联性分析，发掘出4个与两种烟草基因型的5个钾积累阶段相符合的特征性模块，第1、2个模块的基因整体表现的趋势与钾积累过程相一致，但第2个模块内，两种基因型的表达量恰好相反，既表明了钾积累过程中含有共性调控基因（簇），也显示了两种不同基因型材料的差异性;第3、4个模块则显示了钾积累过程的阶段性差异。

目录

声明

论文说明

摘要

符号说明

第一章绪论

2．1钾肥资源与土壤钾素研究现状

2．2烟草钾素营养功能

2．3烟草钾素营养代谢规律

2．4烟草富钾营养特性

3研究内容和技术路线

3．1研究内容

3．2技术路线

第二章烟草钾吸收积累规律研究

1材料与方法

1．1试验材料

1．2试验设计与处理

1．3样品采集与准备

1．4测定项目及方法

1．5数据处理与统计分析

2结果与分析

2．1烟叶含钾量的动态变化

2．2烟叶钾积累量的动态变化

2．3烟叶钾含量和累积量的影响因素分析

2．4品种间烟叶钾含量差异

2．5品种间烟叶钾积累量的差异

2．6钾肥运筹对烤烟产量和含钾量的影响

3讨论

3．1烟叶含钾量动态变化

3．2不同烤烟品种烟叶钾积累规律

4小结

第三章烤烟含钾量的基因型差异评价筛选

1．1试验材料

1．2试验设计与处理

1．3样品采集与制备

1．4测定项目及方法

1．5数据处理

2结果与分析

2．1供试烤烟品种材料含钾量的变化特征

2．2富钾基因型烤烟筛选

2．3不同基因型烤烟间烟叶含钾量差异

2．4不同烤烟品种烟叶含钾量变化的影响因素分析

3讨论

3．1烟叶含钾量的基因型差异

3．2环境因素对烟叶含钾量的影响

4小结

第四章富钾基因型烤烟土壤根际特征研究

1材料与方法

1．1试验材料

1．2试验设计与处理

1．3样品采集与制备

1．4测定项目及方法

1．5数据分析

2结果与分析

2．1施钾量对富钾基因型烤烟根际土壤钾形态的影响

2．2施钾量对富钾基因型烤烟根际土壤酶活性的影响

2．3施钾量对富钾基因型烤烟根际土壤pH的影响

3讨论

3．1施钾处理与土壤钾形态的关系

3．2土壤钾形态与土壤酶活性的关系

3．3土壤钾形态与pH的关系

4小结

第五章富钾基因型烤烟根系响应特征研究

1材料与方法

1．1试验材料

1．2试验设计与处理

1．3样品采集与准备

1．4测定项目及方法

1．5数据分析

2结果与分析

2．1不同供钾水平下富钾基因型烤烟的生物量与钾含量

2．2不同供钾水平下富钾基因型烤烟的根系形态

2．3不同供钾水平下富钾基因型烤烟的根系生理特性

3讨论

3．1富钾基因型烤烟的根系形态特征

3．2富钾基因型烤烟的根系生理特征

4小结

第六章富钾基因型烤烟生理生化特性研究

1．2试验设计与处理

1．3样品采集与准备

1．4测定项目与方法

1．5数据分析

2结果与分析

2．1不同施钾处理下富钾基因型烤烟生物量

2．2不同施钾处理下富钾基因型烤烟钾含量

2．3不同施钾处理下富钾基因型烤烟叶绿素含量

2．4不同施钾处理下富钾基因型烤烟酶活性

3讨论

3．1施钾量对富钾基因型烤烟生长与钾含量的影响

3．2施钾量对富钾基因型烤烟叶绿色含量的影响

3．3施钾量对富钾基因型烤烟酶活性的影响

4小结

第七章烤烟钾积累过程中的转录组分析

1材料与方法

1．1试验材料

1．2试验设计与处理

1．3样品采集与准备

1．4测定项目及方法

1．5 RNA提取与文库构建

1．6测序

1．7数据处理

2结果与分析

2．1烤烟叶片钾积累量的动态变化

2．2不同钾积累阶段烤烟叶片测序与序列组装分析

2．3不同钾积累阶段烤烟叶片基因表达统计分析

2．4不同钾积累阶段烤烟叶片基因表达差异分析

2．5不同阶段烤烟钾积累过程的基因共表达网络分析

3讨论

3．1烟草转录组测序及应用

3．2不同钾积累阶段的基因共表达网络模式

4小结

第八章全文主要结论和研究展望

1全文主要结论

2创新点

3研究展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间取得成果情况