地衣芽孢杆菌H2对坏死性肠炎肉鸡回肠菌群结构的影响

摘要

鸡的坏死性肠炎是一种严重肠道疾病，它可以引起宿主肠道菌群紊乱。鸡坏死性肠炎爆发往往对经济造成严重的影响。然而，关于地衣芽孢杆菌防治鸡的坏死性肠炎的研究较少。所以，本试验通过对1日龄肉鸡饲喂地衣芽孢杆菌，探究其对由球虫、鱼粉和产气荚膜梭菌共同引起的坏死性肠炎肉鸡回肠菌群结构的影响，从而为地衣芽孢杆菌防治肉鸡坏死性肠炎提供理论基础。
　　将240只1日龄肉鸡随机分成四组，分别为空白对照组（NC组）、球虫鱼粉组（FC组）、造模组(PC组)和地衣芽孢杆菌防治组(BL组)，每组60只肉鸡，分为5个重复，每个重复12只。饲养期为28d，期间24h光照，自由采食和饮水，每天观察鸡群的采食、饮水与健康情况。试验期间处理:①1-13d所有组均饲喂基础日粮一。②从14d起，除NC组外其余各组饲喂基础日粮二。③15d，除NC组外其余各组灌喂球虫（100万卵囊/mL，1mL/只），NC组灌喂等体积生理盐水。④18-20d，PC组和BL组每只肉鸡每天灌喂浓度为1.0×108CFU/mL的产气荚膜梭菌1mL，其余各组灌喂等体积生理盐水。⑤21-27d，饲喂基础日粮一。试验期间，BL组肉鸡全程在基础日粮中拌入0.1％地衣芽孢杆菌H2全菌液，其菌液浓度为1.0×109CFU/mL。结果表明:
　　1.试验过程中，PC组有4只肉鸡死亡，死亡率为6.7％，其余各组没有肉鸡死亡。各组肉鸡生长性能指标:14日龄时，BL组肉鸡的体增重和料重比与其他组间均存在显著性差异(P＜0.05)，其他各组间差异不显著(P＞0.05)。22日龄时，体增重和料重比在NC组和PC组中存在显著差异(P＜0.05)，其他各组间差异不显著(P＞0.05)。28日龄时，NC组和BL组肉鸡的体增重和料重比与PC组存在显著性差异（P＜0.05），其他各组间差异不显著（P＞0.05）。
　　2.利用高通量扩增子测序技术检测22日龄肉鸡回肠内菌群，60只肉鸡共获得1532759条tags，被归类于4883个OTUs，样品平均tags为25546±9653条，平均OTUs为428±172个。Alpha指数表明PC组物种丰富度显著高于NC组，BL组与NC组相比在丰富度和多样性上都不存在显著差异。Beta多样性分析结果显示NC组与BL组组间差异最小，而与PC组差异最大。物种注释结果显示，在门水平共获得35个菌门，优势菌门有7个，其中6个在门水平被明确分类。明确分类优势菌门中，NC组和PC组相比厚壁菌门、变形杆菌门和拟杆菌门的相对丰度有显著性差异（P＜0.05）。在纲水平共获得81个菌纲，优势菌纲有6个，其中5个在纲水平被明确分类。明确分类优势菌纲中，NC组和PC组相比芽孢杆菌纲、伽马变形菌纲和拟杆菌纲的相对丰度有显著性差异（P＜0.05），与BL组芽孢杆菌纲的相对丰度呈现显著差异(P＜0.05)。与BL组相比，PC组拟杆菌纲的相对丰度有极显著性差异(P＜0.05)。在目水平共获得147个菌目，优势菌目有8个，其中7个在目水平被明确分类。明确分类优势菌目中，NC组和PC组相比乳杆菌目、芽孢杆菌目和肠杆菌目的相对丰度有显著差异(P＜0.05)，与BL组乳杆菌目和芽孢杆菌目的相对丰度呈现显著差异(P＜0.05)。在科水平共获得248个菌科，优势菌科有13个，其中11个在科水平被明确分类。明确分类优势菌科中，NC组和PC组相比乳杆菌科、肠杆菌科和毛螺菌科的相对丰度有显著性差异（P＜0.05），与BL组乳杆菌科的相对丰度呈现显著差异(P＜0.05)，与BL组相比PC组毛螺菌科的相对丰度有极显著性差异(P＜0.05)。在属水平共获得422个菌属。其中，优势菌属有14个，其中9个是有明确分类的菌属。通过LEfSe对全菌属进行分析表明NC组与PC组存在21个显著差异菌属而与BL组仅有2个显著差异菌属。PICRUSt基因预测显示，PC组聚糖生物合成与代谢能力强，这可能与其回肠内瘤胃球菌属增多有关。BL组肿瘤抑制基因p53通路显著高于其他组，这可能与BL组幽门杆菌低于其他组有关。
　　3.利用实时荧光定量PCR对14、22和28日龄肉鸡的回肠内总菌、拟杆菌门、厚壁菌门、肠杆菌科和乳杆菌属检测。结果表明14日龄，检测菌群在各组间没有显著差异。22日龄时，NC组肉鸡回肠内的总菌与FC组和PC组存在显著差异(P＜0.05)，厚壁菌门在NC组与FC组间存在显著性差异（P＜0.05），其余各组间差异不显著（P＞0.05）。28日龄时，PC组肉鸡回肠内的总菌与NC组相比显著增加（P＜0.05），拟杆菌门的数量在PC组肉鸡的回肠内显著高于（P＜0.05）NC组和FC组，PC组肉鸡回肠内厚壁菌门数量显著(P＜0.05)高于NC组，FC组肉鸡回肠内肠杆菌科显著低于（P＜0.05）NC组和BL组，NC组与FC组和PC组肉鸡回肠在乳酸菌属的数量差异显著(P＜0.05)。BL组与PC组肉鸡回肠乳酸菌属的数量差异显著（P＜0.05）。
　　4.利用PCR-DGGE对各组肉鸡回肠菌群结构进行分析。结果表明14日龄时，NC组和BL组样品分别聚为两簇。22日龄时，与PC组相比NC组样品与BL组更相似，并且BL组和NC组其组内差异性更小。28日龄时，BL组和NC组聚为一簇，而PC组和FC组为一簇，最后各组各自聚为一簇。
　　研究结果表明饲料中添加地衣芽孢杆菌H2不仅能够促进肉鸡的生长，而且具有抵御坏死性肠炎，防治肠道菌群紊乱和帮助患病宿主迅速恢复健康的能力。总之，饲喂地衣芽孢杆菌H2对肉鸡的健康有良好的促进作用。

目录

声明

摘要

符号说明

1文献综述

1．1鸡的肠道微生物

1．1．1鸡肠道的微生物组成

1．1．2鸡肠道菌群对宿主作用

1．2鸡的坏死性肠炎

1．2．1鸡坏死性肠炎的概述

1．2．2鸡坏死性肠炎的诱发因素

1．2．3鸡坏死性肠炎对肠道微生物的影响

1．3益生菌

1．3．1益生菌的介绍

1．3．2几种常见益生菌的研究

1．4肠道微生物的检验方法

1．4．1变性梯度凝胶电泳在肠道微生物研究中的应用

1．4．2实时荧光定量PCR在肠道微生物研究中的应用

1．4．3高通量扩增子测序技术在肠道微生物研究中的应用

1．5本研究目的及意义

2材料与方法

2．1主要试剂及仪器

2．2试验材料

2．3试验动物及饲料配方

2．4试验方法

2．4．1试验分组及处理

2．4．2肉鸡生长性能测定

2．4．3回肠样品的采集

2．4．4细菌总DNA的提取

2．4．5高通量扩增子测序对22日龄肉鸡回肠肠道菌群的检测及分析

2．4．6实时荧光定量PCR对不同日龄肉鸡回肠目标菌群的检测及分析

2．4．7变性梯度凝胶电泳对不同日龄肉鸡回肠菌群结构检测及分析

3结果与讨论

3．1坏死性肠炎肉鸡的病理变化分析

3．2肉鸡生长性能

3．3通过高通量测序技术分析22日龄肉鸡回肠菌群检测

3．3．1样品OTUs分析

3．3．2 Alpha多样性分析

3．3．3 Beta多样性分析

3．3．4物种注释分析

3．3．5 LDA Effect Size(LEfSe)分析

3．3．6几种肠道健康相关菌属的柱状图

3．3．7 PICRUSt基因预测

3．4不同日龄肉鸡菌群分析

3．4．1采用q-PCR分析不同日龄肉鸡回肠目标菌群

3．4．2采用PCR-DGGE分析不同日龄肉鸡回肠菌群落结构

4讨论

4．1坏死性肠炎肉鸡的病理变化及生长性能分析

4．2通过高通量测序技术分析22日龄肉鸡回肠菌群

4．3采用q-PCR分析不同日龄肉鸡回肠目标菌群

4．4采用PCR-DGGE分析不同日龄肉鸡回肠菌群落结构

5结论

参考文献

致谢

作者简历