地衣芽孢杆菌H2对坏死性肠炎肉鸡盲肠菌群的调控作用

摘要

本研究旨在利用Illumina MiSeq高通量测序技术、荧光定量PCR技术、PCR-DGGE技术研究正常肉鸡盲肠微生物组成以及地衣芽孢杆菌对患坏死性肠炎肉鸡盲肠菌群的调控作用。
　　共240只1日龄体重相似的肉鸡被随机分为四组。四个组的设计为:空白组饲喂基础日粮;造模组饲喂高鱼粉型日粮，并使用产气荚膜梭菌与球虫进行攻毒;消除组饲喂高鱼粉型日粮，灌胃球虫;预防组全程饲喂地衣芽孢杆菌，其余处理与造模组相同。22日龄时，每组随机选取15只肉鸡，采集盲肠样品进行高通量测序、荧光定量PCR以及PCR-DGGE检测。14日龄与28日龄时，每组随机选取5只肉鸡，采集盲肠样品进行荧光定量PCR与PCR-DGGE检测。检测结果及分析如下:
　　健康肉鸡盲肠菌群的高通量分析结果表明:稀释曲线进入平台期，此次高通量测序深度满足分析要求;只有少数样品与其他样品的Beta多样性差异较大;物种注释分析结果显示，健康肉鸡盲肠菌群主要由拟杆菌门Bacteroidetes、厚壁菌门Firmicutes、变形菌门Proteobacteria、柔膜菌门Tenericutes组成，这四个菌门总共占到总体群落的98.8％;KEGG数据库对比分析发现，盲肠菌群前三种基因功能为:转运分子、嘌呤代谢、DNA修复重组蛋白。该部分首次对健康肉鸡盲肠菌群进行了系统探究，为进一步分析奠定了基础。
　　产气荚膜梭菌及诱导因素影响肉鸡盲肠菌群的高通量分析结果表明:Alpha多样性显示，空白组，消除组，造模组三组的香农指数依次增加。对于赵氏指数和物种观察指数，消除组与空白组有极显著差异，但造模组与空白组之间并没有显著差异;PCoA分析显示，消除组与造模组的样本点分离度更高，表明组内差异更大。造模组与空白组的样品点接近于完全分离，表明造模组与空白组的菌群结构存在显著差异;通过Venn图统计显示，在162个分类群中，造模组所特有的数量更多（37个）且占比最高(22.8％)。该部分结果说明造模组肉鸡盲肠菌群的特异性更高，证明产气荚膜梭菌能够导致盲肠菌群的紊乱。
　　地衣芽孢杆菌调控作用的相关高通量分析表明:Alpha多样性显示，预防组与空白组、造模组没有显著差异。对于赵氏指数和物种观察指数，三组均没有显著差异;对于PCoA分析，从组内来说，预防组的各个样品点距离更近，聚集程度更高，说明组内差异小。从组间来说，预防组的样品点与空白组更接近，说明两组肉鸡盲肠菌群结构更相似;所占比例最高的前15种菌属的分析显示，三组共有的菌属数量为12种，占总数的三分之二，说明各组在高丰度菌属组成上有较高的一致性。然而，具体到每种菌属的相对丰度在各组当中的排序却有所不同;进一步采用LDA Effect Size方法对这些差异菌属进行分析，结果显示空白组与预防组拥有更少的显著差异菌属，而空白组与造模组则拥有多达21种显著差异的菌属。同时，与造模组相比，预防组和空白组肉鸡盲肠中有四种菌属的相对丰度显著升高，分别为:Bacteroides，Helicobacter，Megamonas和Akkermansia。和造模组相比，预防组肉鸡盲肠菌群的组成与空白组更加接近，说明地衣芽孢杆菌对盲肠菌群具有良好的调控效果;PICRUSt分析则显示，造模组肉鸡盲肠菌群的基因功能组成与空白组以及预防组相比差异更大，而空白组和预防组之间的差异更小，证明空白组与预防组肉鸡盲肠菌群在基因功能上更具有相似性。
　　对不同日龄肉鸡盲肠菌群使用荧光定量PCR与PCR-DGGE的分析表明:14日龄时，五种检测菌群在空白组与预防组肉鸡盲肠之中的拷贝数均没有显著差异。PCR-DGGE则显示，聚类从一开始就分为两簇，说明空白组和预防组肉鸡的盲肠微生物结构出现了差异;22日龄时，空白组的总菌，厚壁菌门与肠杆菌科拷贝数均显著高于造模组。PCR-DGGE结果表明造模组肉鸡盲肠菌群出现了紊乱，不仅组内样品的差异较大，与其余三组的菌群结构也有较大区别;28日龄时，盲肠菌群逐渐趋于稳定，对于总菌，厚壁菌门与拟杆菌门而言，其拷贝数在四个组之间均没有显著差异。PCR-DGGE结果显示预防组的两个样品和空白组的三个样品的相似度在0.74以上，说明预防组肉鸡盲肠菌群与空白组之间仍有较高的相似性。
　　结果表明，饲喂地衣芽孢杆菌后的肉鸡盲肠微生物在结构和功能上趋近于空白组肉鸡，表明地衣芽孢杆菌能够调控盲肠菌群，提高肉鸡的健康程度。

目录

声明

摘要

符号说明

1文献综述

1．1肉鸡坏死性肠炎的研究概述

1．1．1产气荚膜梭菌

1．1．2坏死性肠炎的特征及危害

1．2肉鸡坏死性肠炎的防治措施

1．2．1传统治疗方式

1．2．2新型治疗方式

1．2．3益生菌对肉鸡坏死性肠炎的防治研究

1．3肠道菌群研究方法概述

1．3．1 PCR-DGGE技术

1．3．2荧光定量PCR技术

1．3．3二代测序技术

1．4本研究目的及意义

2材料与方法

2．1试验材料

2．1．1试验菌株

2．1．2试验动物及日粮

2．1．3主要试剂与仪器

2．2试验方法

2．2．1动物试验设计

2．2．2样品采集与处理

2．2．3 Illumina MiSeq测序分析流程

2．2．4荧光定量PCR分析盲肠内容物特定菌群

2．2．5 PCR-DGGE分析盲肠菌群结构

3结果与分析

3．1健康肉鸡盲肠菌群的高通量测序分析

3．2造模组22日龄肉鸡盲肠菌群的特征以及地衣芽孢杆菌对肉鸡盲肠菌群的调控作用

3．2．1产气荚膜梭菌及诱导因素对肉鸡盲肠菌群的影响

3．2．2地衣芽孢杆菌对22日龄肉鸡盲肠菌群的调控作用

3．3不同日龄肉鸡盲肠菌群分析

3．3．1荧光定量PCR对不同日龄肉鸡盲肠特定菌群的分析

3．3．2 PCR-DGGE对不同日龄肉鸡盲肠菌群结构的分析

4讨论

4．1健康肉鸡盲肠菌群的高通量测序分析

4．2造模组肉鸡盲肠菌群的特征

4．3地衣芽孢杆菌对肉鸡盲肠菌群的调控作用

4．4通过荧光定量PCR与PCR-DGGE对不同日龄肉鸡盲肠菌群的分析

4．4．1荧光定量PCR对不同日龄肉鸡盲肠特定菌群的分析

4．4．2 PCR-DGGE对不同日龄肉鸡盲肠菌群结构的分析

5结论

参考文献

致谢

简历