亚硒酸钠对脱氧雪腐镰刀菌烯醇致GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞氧化损伤的保护作用

摘要

目的：
　　脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)在饲料、饲料原料中的污染严重。DON可作用于免疫系统，其能引起免疫细胞的氧化损伤。硒有着抗氧化的功能。本研究使用RNAi技术建立GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞，通过单独/联合添加脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、亚硒酸钠(Na2SeO3)，探究DON致GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞氧化损伤作用，Na2SeO3对DON致GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞氧化损伤的保护作用进而探究硒是否是通过硒蛋白GPx1拮抗DON毒性。
　　方法:
　　(1)GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞的建立:应用RNAi、流式细胞术、qPCR和Western Blot技术建立GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞。(2)抗氧化指标的检测:试验分为11组，分别为D1(DON824ng/mL)，D2(DON412ng/mL)，D3(DON206ng/mL),D4(DON103ng/mL),S(Na2SeO32μmol/L),SD1(Na2SeO32μmol/L+DON824ng/mL),SD2(Na2SeO32μmol/L+DON412ng/mL),SD3(Na2SeO32μmol/L+DON206ng/mL),SD4(Na2SeO32μmol/L+DON103ng/mL),P（正常细胞），M（敲低组细胞），分别检测DON、Na2SeO3单独或联合作用6、12和24h对GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞SOD和CAT酶活力，GSH、H2O2、MDA含量，T-AOC和细胞抑制羟自由基能力;DON和Na2SeO3单独或联合作用24h时对GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞ROS的含量。计算上述指标结果中SD组与D组之间的变化率，与赵传平硕士学位论文中原代培养猪脾脏淋巴抗氧化指标的SD组与D组之间的变化率作对比。
　　结果:
　　(1)GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞的建立:
　　流式细胞术检测siRNA转染效率最高达92.5％。试验中所用的GPx1siRNA能够抑制猪脾脏淋巴细胞中GPx1mRNA表达，表达量为对照组的28.4％，差异显著（P＜0.05）。Western Blot结果显示敲低组中GPx1蛋白的表达受到了抑制，表达量为对照组的36.9％，差异显著(P＜0.05)。上述结果表明GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞建立成功。
　　(2)抗氧化指标的检测:
　　GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞（M组）中的MDA和H2O2含量均显著高于正常猪脾脏淋巴细胞（P组）(P＜0.01)，而GSH含量、T-AOC、ROS含量及细胞抑制羟自由基的能力均显著低于P组(P＜0.05或P＜0.01)，即使培养较短的时间(6h)，SOD活力、CAT活力也低于P组。
　　DON单独染毒GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞，分别培养6、12和24h，D组细胞的MDA和H2O2含量均显著高于M组(P＜0.01)，SOD和CAT活力，GSH含量，细胞T-AOC和细胞抑制羟自由基的能力绝大部分显著低于M组(P＜0.01)。培养24h时，除D4组外，其余组ROS含量相对于M组均显著升高(P＜0.01)。
　　单独添加Na2SeO3于GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞作用6、12和24h，Se组细胞的MDA和H2O2含量均低于M组，SOD和CAT活力，GSH含量，细胞T-AOC和细胞抑制羟自由基的能力均显著高于M组(P＜0.05或P＜0.01)。培养24h时，Se组中ROS含量相较于M组显著降低(P＜0.01)。
　　联合添加DON、Na2SeO3与GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞作用6、12和24h，SD组细胞的MDA和H2O2含量均显著高于D组(P＜0.01)，SOD和CAT活力，GSH含量，细胞T-AOC和细胞抑制羟自由基的能力绝大部分显著低于D组（P＜0.05或P＜0.01）。培养24h时，除SD1组外，SD组的ROS含量相对于对应的D组均显著下降(P＜0.01)。本试验中SD组与D组的变化率绝大部分低于赵传平硕士学位论文中的SD组与D组的变化率，说明敲低了GPx1后再加入Na2SeO3，MDA、H2O2含量降低的比例和SOD和CAT活力，GSH含量，细胞T-AOC与细胞抑制羟自由基的能力升高的比例均低于正常细胞，表明敲低了GPx1再加入Na2SeO3，Na2SeO3对DON诱导的细胞氧化损伤的拮抗作用降低。
　　结论:
　　(1)成功建立GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞。
　　(2)DON单独作用于GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞，可使其遭受到相较正常猪脾脏淋巴细胞更大的氧化损伤，表明当硒蛋白GPx1表达量降低后，猪脾脏淋巴细胞对DON的抵抗能力降低。联合添加Na2SeO3和DON，Na2SeO3可以拮抗DON致GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞的氧化损伤，但拮抗能力大幅降低;表明Na2SeO3在拮抗DON毒性时要通过硒蛋白GPx1。

目录

声明

摘要

英文缩写词

第一章文献综述

1．1脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性及其机制研究进展

1．1．1 DON的理化性质

1．1．2 DON的污染情况

1．1．3 DON诱导的氧化应激及机制

1．1．4 DON对脾脏的损伤

1．2硒的抗氧化作用

1．2．1微量元素硒的概述及硒的抗氧化作用

1．2．2硒蛋白GPx1的抗氧化作用

1．2．3添加硒对细胞或机体内的硒蛋白GPx1的影响

1．3 RNA干扰技术及其应用

1．4研究目的意义

第二章体外GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞的建立

2．1试验材料

2．1．1试验动物

2．1．2主要仪器

2．1．3主要试剂

2．2试验方法

2．2．1猪脾脏淋巴细胞悬液制备

2．2．2 GPx1敲低型猪脾淋巴细胞的建立

2．3试验结果

2．3．2 GPx1 mRNA相对表达量检测

2．3．3 GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞中GPxl蛋白的表达

2．4讨论

2．5小结

第三章DON及Na2SeO3单独或联合作用对猪脾脏淋巴细胞GPx1敲低模型抗氧化功能的影响

3．1试验材料

3．1．1试验模型

3．1．2主要仪器

3．1．3主要试剂

3．2试验方法

3．2．1样品分组及处理

3．2．2检测指标及方法

3．3数据分析

3．4试验结果

3．4．1 DON及Na2SeO3单独或联合作用对GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞H2O2含量的影响

3．4．2 DON及Na2SeO3单独或联合作用对GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞MDA含量的影响

3．4．3 DON及Na2SeO3单独或联合作用对GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞SOD活性的影响

3．4．4 DON及Na2SeO 3单独或联合作用对GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞CAT活性的影响

3．4．5 DON及Na2SeO3单独或联合作用对GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞GSH含量的影响

3．4．6 DON及Na2SeO3单独或联合作用对GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞T-AOC的影响

3．4．7 DON及Na2SeO3单独或联合作用对GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞抑制羟自由基能力的影响

3．4．8 DON及Na2SeO3单独或联合作用对GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞ROS含量的影响

3．5讨论

3．5．2 DON对GPx1敲低型淋巴细胞的氧化损伤及抗氧化功能的影响

3．5．3 Na2SeO3对GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞自身氧化损伤的保护作用

3．5．4 Na2SeO3对DON致GPx1敲低型猪脾脏淋巴细胞氧化损伤的抑制作用

3．6小结

全文结论

参考文献

致谢

作者简历