芸薹根肿菌遗传多样性分析及其SCAR标记的建立

摘要

为了探明来自全国范围内芸薹根肿菌的遗传多样性，及其与Williams鉴别系统鉴定生理小种结果之间的关系。对100条ISSR引物以及13条RAPD引物进行筛选，筛选得到3条ISSR引物以及1条RAPD引物对来自全国的48株根肿菌进行扩增。3条ISSR引物对病原菌共扩增出44条带，多态性比例为97.73％，平均每条引物的多态条带数14.33。3条ISSR引物中引物889的多态性比例最小为94.11％，另外2条的多态性比例均达到100％。RAPD引物M05共扩增出16条带，多态性比例为100％。
　　根据扩增条带图构建UPGMA聚类图。ISSR聚类图结果表明，48株根肿菌菌株之间的遗传相似系数范围为0.58～1.00。当遗传相似系数为0.5805时，48株根肿菌可分为类群Ⅰ以及类群Ⅱ。在不同的遗传相似系数水平上，类群Ⅰ的菌株又可被归为不同的亚类群。菌株的地理来源与其遗传背景相关性不大。ISSR聚类分析结果可以将11号生理小种与其它生理小种区分开来，但是却不能与生理小种的结果一一对应。
　　RAPD聚类图结果表明，48株根肿菌菌株之间的遗传相似系数范围为0.5625～1.00。当遗传相似系数为0.5625时，48株菌株可分为类群Ⅰ以及类群Ⅱ。在不同的遗传相似系数水平上，类群Ⅰ的菌株又可分割为不同的亚类群。根肿菌的遗传背景与其地理来源之间没有必然的联系。RAPD聚类分析结果与根肿菌生理小种的鉴定结果之间没有明显相关联。
　　从ISSR引物扩增出来的条带里选取9条保守片段进行胶回收，并进行克隆、转化以及阳性转化子的PCR验证，6条片段成功转化，转化成功的菌液送去测序，再根据测序结果设计SCAR引物，对48个根肿菌DNA进行PCR扩增，两条片段的引物不能得到清晰单一条带，推测这两条片段基因可能在根肿菌基因中多处存在，另外4条片段的SCAR引物引物可以得到单一清晰条带，作为保守序列，这4条片段可能与根肿菌功能基因相关，也可作为根肿菌分子鉴定的引物。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1．2根肿病症状

1．3根肿病病原分类地位

2根肿菌寄主范围

3根肿菌的生活史

4根肿菌生理小种鉴定

5根肿菌遗传多样性研究

5．1 ISSR(简单重复序列间)

5．2 RAPD(随机扩增多态性DNA)

5．3 SCAR(序列特异性扩增)标记

5．4根肿菌遗传多样性研究进展

6根肿病的防治

6．1化学防治

6．2生物防治

6．3农业措施防治

6．4种植抗病品种

6．5综合防治

7研究目的、意义、内容与技术路线

7．1研究目的与意义

7．2实验内容

7．3技术路线

第二章根肿菌遗传多样性分析

1．1菌株来源

1．2试剂

1．3实验仪器

2方法

2．1菌悬液的制备

2．2休眠孢子DNA提取

2．3 DNA质量检测

2．4 ISSR-PCR扩增

2．5 RAPD-PCR扩增

2．6 ISSR引物退火温度的筛选

2．7 RAPD引物退火温度的筛选

2．8引物的筛选

2．9数据处理

3结果与分析

3．1 ISSR引物退火温度的筛选结果

3．2 RAPD引物退火温度筛选结果

3．3 ISSR引物筛选结果

3．4 RAPD引物筛选结果

3．5 ISSR-PCR扩增结果

3．6 RAPD-PCR扩增结果

3．7根肿菌ISSR遗传多样性分析

3．8根肿菌RAPD遗传多样性分析

4讨论

第三章根肿菌SCAR标记的建立

1．4实验仪器

2实验方法

2．1目的片段的回收

2．2目的片段的克隆与转化

2．3目的片段的测序及验证

2．4 SCAR引物的设计与合成

2．5 SCAR引物的退火温度的优化

2．6 SCAR引物全模板的扩增

3结果

3．1特异性片段回收

3．2阳性转化子的验证

3．3阳性转化子的测序

3．4 SCAR引物的设计

3．5引物退火温度的筛选

3．6 SCAR引物对全模板PCR

4讨论

第四章主要结论与展望

2展望

参考文献

附录

致谢