山羊PTEN基因的变异位点及组织表达分析

摘要

PTEN（phosphate and tension homology deleted on chromosome ten）基因是人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因，属于蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTP)基因家族。PTEN基因最初被认为是抑癌基因，但是PTEN基因也在哺乳动物细胞的生长、器官的发育以及糖代谢、胰岛素抵抗等方面发挥作用。因此，探究PTEN基因在山羊上的表达特征和作用机制具有重要意义。
　　本研究通过克隆山羊PTEN基因编码区全序列以及3'UTR区域变异位点的检测，探究PTEN基因的分子特征。RT-qPCR的方法检测了其在胚胎期90天(E90)、胚胎期135天(E135)和出生后90天(P90)的山羊心、肝、脾、肺、肾、脑、腰大肌和背最长肌8个组织中的表达差异以及在山羊前体脂肪细胞分化过程中PTEN基因的表达特征。主要结果如下:
　　1、简州大耳羊PTEN基因的编码区长度为1212bp，编码403个氨基酸。其GenBank登录号为:MG923848。PTEN蛋白是亲水蛋白，含有26个磷酸化位点，1个信号肽。山羊的PTEN基因序列与绵羊，牛PTEN基因亲缘关系较近，与马PTEN基因亲缘关系最远。在PTEN基因的3'UTR区发现了3个SNPs和1个indel，分别是g.84T＞C(rs648781865)，g.996T＞C(rs661678942)和未报道的g.1007C＞A，g.1103_104de lAT。
　　2、RT-qPCR结果显示PTEN基因在E90、E135和P90简州大耳羊的心、肝、脾、肺、肾、脑、腰大肌和背最长肌组织中均有表达。E90的肝组织中检测到的PTEN基因表达水平相对较高（P＜0.05）;E135的肺组织中检测到的PTEN基因表达水平相对较高(P＜0.05)，心和腰大肌中表达水平较低(P＜0.05);P90的脾组织中PTEN表达量较高(P＜0.05)。蛋白免疫印迹杂交结果显示，在E135的8个组织中，PTEN蛋白在心、脾和脑组织中表达量显著高于其他五个组织（P＜0.05），而背最长肌中的表达量显著低于其他7个组织(P＜0.05)。此外，PTEN蛋白在简州大耳羊肺组织中的表达量随日龄呈下降趋势。
　　3、DAB显色原位杂交的方法检测了PTEN基因在P90简州大耳羊8个组织中的分布规律。结果发现PTEN基因在肝、脾、肺和肾组织中表达较高，在心、脑和腰大肌和背最长肌中表达较低，与RT-qPCR的结果一致。
　　4、探究PTEN基因在山羊前体脂肪细胞分化过程中的表达变化，结果PTEN基因的表达量总体呈现逐渐降低的趋势，在分化第10天略有升高。而且分化第2天PTEN基因的表达量显著高于其他4个时间点（P＜0.05）。

目录

论文说明

声明

摘要

符号说明

1文献综述

1．3 PTEN基因的研究进展

1．3．1 PTEN基因是胚胎发育的标志基因

1．3．4 PTEN基因影响内脏功能

1．4PTEN基因表达的调控

1．4．1转录水平的调控

1．4．2 mRNA的调控

1．4．3磷酸化作用

1．4．4乙酰化作用

1．4．5氧化作用

1．4．6泛素化作用

1．4．7蛋白间相互作用

1．5本研究的目的和意义

2材料与方法

2．1试验材料

2．1．1试验样品采集

2．1．2主要仪器设备

2．1．3主要试剂及试剂盒

2．2实验方法

2．2．1组织总RNA的提取

2．2．2 RNA浓度和纯度的检测及测定

2．2．3反转录

2．2．4引物设计

2．2．5 PTEN基因的cDNA克隆测序

2．2．6生物信息学分析

2．2．7 PTEN基因变异位点的测定

2．2．8实时荧光定量PCR

2．2．9 Western Blot

2．2．10脂肪细胞诱导分化

2．2．11 DAB显色原位杂交

2．2．12数据处理

3结果与分析

3．1总RNA检测

3．2．1 PTEN基因克隆结果

3．2．2 PTEN基因克隆产物测序

3．2．3 PTEN基因序列同源性分析及进化树的构建

3．2．4 PTEN蛋白理化性质分析

3．3变异位点检测结果

3．4 PTEN基因在不同山羊组织的表达

3．4．1 PTEN基因mRNA相对表达结果

3．4．2 PTEN蛋白表达结果

3．5PTEN基因在山羊前体脂肪细胞分化过程中的表达

3．6 DAB显色原位杂交

4讨论

4．1 PTEN基因的生物信息学分析

4．3 PTEN基因的组织表达分析

4．4 PTEN基因与脂肪细胞分化

5结论

参考文献

致谢

作者简历