宿主蛋白DAZAP2对乙型脑炎病毒增殖与复制的影响研究

摘要

日本乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）的NS1蛋白是其重要的非结构蛋白，在病毒的增殖、复制、装配、免疫逃避等方面发挥重要作用。前期研究发现宿主蛋白DAZAP2是NS1蛋白的互作蛋白之一，本研究旨在探究宿主蛋白DAZAP2对乙脑病毒的增殖复制是否有影响，进一步揭示宿主蛋白DAZAP2在乙脑病毒增殖与复制中发挥的作用。首先，构建DAZAP2基因的靶向干扰质粒和DAZAP2基因敲除细胞系及检测用标准曲线。研究中成功构建针对DAZAP2基因的靶向干扰质粒，最高干扰效率达53.7％;运用CRISPR/Cas9技术成功构建DAZAP2基因敲除细胞系;成功构建了用于检测干扰质粒转染水平、DAZAP2基因表达情况、评价JEV mRNA水平的NS1基因、E基因及细胞内参β-actin的荧光定量标准曲线，R2均大于0.99;其次，对DAZAP2蛋白的表达抑制干扰发现其正向调节了JEV的mRNA和子代病毒粒子水平。干扰293细胞上宿主蛋白DAZAP2的表达后，相对荧光定量和WB检测显示JEV增殖复制无明显变化，推断可能由于shRNA的靶向位点的沉默效率不够;在DAZAP2基因敲除细胞系上，接种JEV，运用相对荧光定量、WB及蚀斑分析，发现JEV mRNA水平较对照组提高约1.6倍，子代病毒滴度为6.35pfu/ml，为对照组的1.27倍，但在该细胞系上转染乙脑病毒复制子，运用相对荧光定量和WB检测，未见明显变化。最后，DAZAP2蛋白过表达发现其影响了JEV mRNA水平。通过相对荧光定量和WB分析，证实过表达宿主蛋白DAZAP2后，感染JEV，其JEV mRNA相较对照组提升约3倍，mRNA水平显著提高。
　　综上结果证实了293细胞的蛋白DAZAP2是一种对JEV的增殖与复制有影响的重要宿主蛋白。

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摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．2乙型脑炎病毒概况

1．3宿主蛋白对黄病毒增殖与复制的影响

1．3．1宿主蛋白与JEV病毒蛋白相互作用对病毒增殖与复制的影响研究

1．3．2宿主蛋白与其他黄病毒蛋白相互作用对病毒增殖与复制的影响研究

1．4研究宿主蛋白对病毒增殖与复制影响的技术

1．4．1 RNA干扰技术研究及应用

1．4．2基因编辑技术的研究及应用

1．4．3黄病毒病毒复制子的研究及应用

1．5本研究目的与意义

第二章DAZAP2蛋白对乙脑病毒增殖复制影响的研究

2．1材料与方法

2．1．1材料

2．1．2实验方法

2．2结果与分析

2．2．1荧光定量检测用标准曲线建立

2．2．2干扰DAZAP2基因表达，感染JEV后病毒水平的变化

2．2．3敲除DAZAP2基因，感染JEV后病毒水平的变化

2．2．4缺失DAZAP2基因的293细胞JEV复制子的复制情况

2．2．5宿主蛋白DAZAP2过表达，感染JEV后病毒mRNA水平的变化

2．3讨论

全文结论

参考文献

致谢

作者简历