鸭疫里默氏菌对利福平的耐药机制初探及rpoB基因突变的适应性研究

摘要

鸭疫里默氏菌(RA)是一种可以感染鸭、鹅、火鸡和其它禽类的细菌性病原体。近年来RA对抗生素利福平的耐药情况日益严重。围绕RA耐利福平机制及RA rpoB基因的突变对其生存和适应性的影响，开展的主要研究内容和结果如下:
　　1.鸭疫里默氏菌利福平耐药机制的研究
　　对110株RA进行利福平MIC测定，89％(98/110)RA对利福平具有耐药性，MIC值在0.5～256μg/mL之间。对18株RA rpoB序列与MIC关联性进行分析、利用定点突变和自然转化技术构建过表达菌株进行验证，结果表明RA rpoB基因5个氨基酸位点的突变(V382I、H491N、R494K、G502K和S539Y)与利福平耐药相关。
　　试验发现RA-CH-1株和RCAD0147株具有相同的rpoB突变，但对利福平MIC却相差8倍，分别是32μg/mL和256μg/mL。利用外排泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)和维拉帕米(VP)进行试验，发现RCAD0147编码有与利福平耐药相关的药物外排泵，它与rpoB突变两种机制共同提高RCAD0147对利福平的耐药水平。
　　2.rpoB突变对RA适应性代价的研究
　　利用RA自发突变试验分离到了15种类型的rpoB突变株，其中R494K与分离株中检测到的突变类型完全一致。经菌落平板计数计算得出rpoB基因突变频率约为10-8，所得突变株中98.8％(247/250)位于rpoB基因利福平耐药决定区簇Ⅰ。除D481Y、I537N和S539F外，其余突变株对利福平MIC至少达到了64μg/mL。位点H491D和484∷TAA的突变导致RA出现生长延迟。体外竞争性试验结果显示突变株适应性降低，且位点H491D和484∷TAA突变株影响最大(相对适应性分别是0.60和0.63)。最后对R494K和H491D突变株的定殖能力和敏感性进行测定，结果与亲本株相比两突变株对H2O2和SNP的敏感性均上升。体内定殖试验表明，24h内两突变株在感染5日龄雏鸭的气管和脑中定殖的活菌数明显降低。该研究表明RA对利福平耐药的突变株中，rpoB基因单突变导致RA适应性减弱，产生了适应性代价。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章文献综述

3鸭疫里默氏菌耐药研究

4细菌对利福平耐药的分子机制

4．1利福平简介

4．2利福平抗菌机制

4．3利福平耐药机制

5适应性代价

6研究目的和意义

第二章鸭疫里默氏菌利福平耐药机制的研究

1试验材料

1．1菌株及培养条件

1．2主要酶、生化试剂

1．3主要培养基配制

1．4抗生素配制

1．5主要缓冲液及试剂配制

1．6主要仪器

1．7 PCR引物设计

2试验方法

2．1 110株RA对利福平耐药性测定

2．2已完成测序的18株RA rpoB基因序列分析

2．3 RpoB过表达菌株ATCC 11845-pLMF03∷rpoB+的构建与鉴定

2．4外排泵抑制试验

3试验结果

3．1 110株RA对利福平耐药性测定结果

3．2 18株RA rpoB序列与其MIC结果分析

3．3 ATCC 11845-pLMF03∷rpoB+过表达菌株的构建与鉴定

3．4外排泵抑制试验结果

4讨论

第三章鸭疫里默氏菌rpoB突变株适应性研究

1试验材料

1．1菌株和试验动物

1．2缓冲液及抗生素配制浓度

1．3 PCR引物设计

1．4统计方法

2试验方法

2．1RpoB自发突变试验

2．2突变株生长曲线的测定

2．3突变株MIC值的测定

2．4突变株体外竞争性的评估

2．5突变株体内定殖能力的评估

2．6突变株敏感性试验

3试验结果

3．1自发突变

3．2突变株生长曲线

3．3突变株体外竞争性

3．4突变株体内定殖能力和体外敏感性评估

4讨论

结论

参考文献

致谢

附录