油橄榄角鲨烯合酶基因OeSQS的克隆及表达分析

摘要

油橄榄（Olea europaea L.）为木犀科(Oleaceae)常绿乔木，是世界著名木本油料作物。油橄榄果实经冷榨所得的橄榄油，是目前公认最健康的食用油，除富含单不饱和脂肪酸外，还含有丰富的三萜类化合物，如角鲨烯(squalene，SQ)、齐墩果酸(oleanolic acid，OA)和山楂酸(Maslinic acid，MA)等。现代药理学研究表明SQ、OA和MA具有抗癌、抗氧化和消炎等药用活性，而且SQ的含量还是评判橄榄油品质的重要指标之一。角鲨烯合酶(squalene synthase，SQS)是植物三萜代谢途径中的一个关键酶，在整个三萜代谢途径中具有重要的枢纽作用，其表达水平的高低对植物中三萜合成通路代谢流有重要影响。因此，对角鲨烯合酶基因克隆和表达研究，已成为在分子生物学水平上研究植物三萜合成代谢的热点。目前，已有对人参、三七、睡茄等植物中该基因的克隆和表达方面的研究，但对油橄榄中的该基因的研究尚未见文献报道。为了初步探明油橄榄中SQS基因的结构、功能和表达特性，本研究以油橄榄果为材料，利用RT-PCR技术克隆得到2个油橄榄SQS基因，并对其进行了生物信息学分析;为进一步验证其生物学功能，对SQS基因进行了原核诱导表达，并对重组蛋白进行了功能验证;为揭示该基因在油橄榄果实发育阶段中对角鲨烯的影响，对油橄榄果实发育阶段中角鲨烯含量与该基因表达量的相关性进行了分析。主要研究结果如下:
　　(1)以油橄榄果实RNA反转录cDNA为模板，利用RT-PCR技术克隆得到油橄榄2个SQS，分别命名为OeSQS1、OeSQS2。经生物信息学分析表明:2个基因的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)序列长度分别为1245bp和1236bp，分别编码414和411个氨基酸，OeSQS1/2相对分子质量分别47.70kDa和46.99kDa，等电点分别为8.20和7.93，均为亲脂性蛋白。同源序列比对分析显示，OeSQS1/2蛋白与其它植物中SQS的保守Ⅱ与Ⅳ区域中均存在与Mg2+结合的天冬氨酸活性位点。OeSQS1/2跨膜结构域集中在Ⅵ区域，且OeSQS1/2均无信号肽，是膜结合蛋白。二者的催化活性位点均位于由α-螺旋折叠形成的单结构域构成的中央疏水空间内。进化树分析结果显示，OeSQS1/2均被聚类在被子植物门双子叶植物纲中，符合传统的植物学分类。
　　(2)成功构建了原核表达载体pET30b(+)-OeSQS1、pET30b(+)-OeSQS2以及删除羧基端跨膜结构域突变体的原核表达载体pET30b(+)-△OeSQS1、pET30b(+)-△OeSQS2，并成功转入大肠杆菌BL21(DE3)中，Western blot实验结果证明重组蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明，含pET30b(+)-OeSQS1、pET30b(+)-OeSQS2重组菌经低温与低浓度IPTG诱导条件优化后均不能得到可溶性蛋白，而含pET30b(+)-△OeSQS1、pET30b(+)-△OeSQS2重组菌在16℃，IPTG浓度为1.0mmol/L，诱导12h条件下成功纯化得到了可溶性的蛋白。通过气相色谱对酶促反应产物进行检测结果显示缺失跨膜结构域的2个重组酶仍具有催化法呢基焦磷酸合成角鲨烯的功能，且催化过程中NADPH必不可少。
　　(3)采用双变量相关统计法对5个时期（开花后40～160d）的2个品种（克罗莱卡与科拉蒂）油橄榄果中OeSQS1和OeSQS2基因的表达量与其对应时期角鲨烯含量进行相关性分析，结果显示2个基因的表达量均与角鲨烯含量存在较强正相关关系(P＜0.05)。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章文献综述

1．1三萜的结构类型及其代表化合物

1．2三萜的药理作用

1．3植物三萜化合物代谢途径及其关键酶

2植物角鲨烯合酶研究进展

2．1植物中角鲨烯合酶基因的克隆及功能验证

2．2角鲨烯合酶结构特征

2．3角鲨烯合酶的催化机制

2．4角鲨烯合酶的表达与调控

3油橄榄研究概况

4研究目的及意义

第二章OeSQS基因的克隆及序列分析

1材料、试剂和仪器

1．1实验材料

1．2试剂

1．3仪器

2实验方法

2．1 PCR引物设计

2．2总RNA的提取及检测

2．3 cDNA第一链的合成

2．4 OeSQS的克隆及测序

2．5 OeSQS基因生物信息学分析

3结果与分析

3．1总RNA的提取

3．2 OeSQS基因的克隆及测序

3．3 OeSQS的生物信息学分析

4讨论

4．2 OeSQS的保守性分析

第三章OeSQS基因的原核表达及催化活性验证

1实验材料、试剂和仪器

1．1实验材料

1．2试剂与溶液

1．3仪器

2实验方法

2．1 OeSQS基因表达载体的构建

2．2 OeSQS重组蛋白小量诱导表达与检测

2．3 OeSQS重组蛋白Western blot分析

2．4．OeSQS蛋白的表达条件优化与可溶性鉴定

2．5 ΔOeSQS重组蛋白的功能验证

3结果与分析

3．1表达载体的构建与检测

3．2重组蛋白小量诱导表达

3．3 Western blot分析

3．4重组OeSQS蛋白表达条件优化及可溶性鉴定

3．5重组蛋白ΔOeSQS的功能验证

4讨论

4．1 OeSQS基因的原核表达

4．2 OeSQS跨膜区以及诱导表达条件对其可溶性影响

4．3重组蛋白的功能验证

第四章OeSQS的基因表达量与角鲨烯积累的相关性分析

2实验方法

2．1总RNA的提取

2．2 cDNA第一链的合成

2．3 OeSQS基因荧光定量PCR

2．4目的基因mRNA相对表达量测定

2．5角鲨烯含量测定

2．6相关性数据的分析

3结果与分析

3．1总RNA的提取

3．2 OeSQS基因在油橄榄果实不同发育时期的表达分析

3．3油橄榄果实不同发育时期的角鲨烯含量分析

3．4相关性分析

4讨论

全文总结

参考文献

致谢

作者简历