百里香酚抗小鼠金黄色葡萄球菌肺炎的药效学评价

摘要

金黄色葡萄球菌（金葡菌）为革兰氏阳性菌，是一种人兽共患病病原，能引起人和动物的多种疾病。金葡菌的致病性主要依靠表面蛋白、外分泌蛋白和多种酶。α-溶血素(Hla)是一种重要的外分泌蛋白，大量的研究表明Hla在金葡菌某些疾病的致病过程中起非常关键的作用，尤其是金葡菌性肺炎、乳房炎和角膜炎。以Hla为靶标在抗金葡菌肺炎过程中具有重要意义，为此从体外溶血实验中筛选出具有抗Hla作用的百里香酚，然后从百里香酚对金葡菌Hla表达的影响、百里香酚对金葡菌Hla介导的肺癌上皮细胞A549损伤的保护作用、百里香酚对小鼠的急性毒性研究和百里香酚对小鼠金葡菌肺炎模型的保护作用的四个角度对小鼠金葡菌肺炎进行药效学评价。
　　本文进行了以下研究:1）通过测定最小抑菌浓度(MIC)、绘制生长曲线、检测溶血活性、蛋白免疫印迹分析和荧光定量PCR（RT-PCR）研究百里香酚在体外对金葡菌Hla表达的影响。
　　2)通过live/dead实验和乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验研究百里香酚对金葡菌Hla介导的肺癌上皮A549细胞损伤的保护作用。
　　3)观察小鼠腹腔注射百里香酚后的临床症状，并通过Bliss法计算百里香酚对小鼠的半数致死量(LD50)。
　　4)通过小鼠感染金葡菌的致死性保护率实验、组织病理学观察、肺湿重/干重（W/D）比和肺菌落计数研究百里香酚对小鼠金葡菌肺炎损伤的保护作用。
　　结果:百里香酚对金葡菌的不同菌株的MIC范围为128-256μg/mL;百里香酚在0-32μg/mL浓度下对金葡菌USA300的生长没有影响;百里香酚具有抑制菌上清溶血的作用且呈一定的浓度依赖性，在浓度为32μg/mL时，金葡菌USA300的溶血活性降至34.8％，差异极显著(p＜0.01);在蛋白免疫印迹中百里香酚随着浓度的增加条带也是变弱的与溶血实验结果基本一致;金葡菌USA300hla和RNAⅢ的转录水平随着药物浓度的增加而降低，当百里香酚浓度为32μg/mL时，与对照组相比hla和RNAⅢ的转录水平分别下降到5.5％和10.5％，差异极显著(p＜0.01)。
　　在金葡菌USA300与A549细胞共培养体系中，随着百里香酚浓度的增加，细胞死亡率减少，当浓度为32μg/mL时LDH的释放量为4.8％，差异极显著(p＜0.01)。
　　小鼠经腹腔注射百里香酚后，临床表现为:精神沉郁，活动减少，身体抽搐，甚至死亡，其临床症状随着剂量的增加而变得更严重。百里香酚通过腹腔注射对小鼠的半数致死量(LD50)为608.246mg/kg，其95％的可信区间为500.149～807.214mg/kg。
　　百里香酚给药组与阳性对照组（只感染8325-4组）相比，能显著减少小鼠的死亡率(p＜0.05);观察肺脏解剖病理学和组织病理学的特征，发现给药组与阳性对照组相比肺部病理变化明显减轻;给药组与阳性对照组相比W/D值明显降低(p＜0.05)。给药组与阳性对照组相比肺脏菌落数明显降低(p＜0.01)，菌落计数分别为:1.1×105CFUs/mg和6.8×107CFUs/mg。
　　结论:百里香酚通过下调hla和RNAⅢ的转录水平而使Hla的表达下降;百里香酚对金葡菌USA300Hla介导的肺癌上皮细胞A549的损伤具有保护作用;百里香酚对小鼠具有轻度毒性;百里香酚对小鼠金葡菌肺炎具有保护作用。该药将有望成为治疗金葡菌肺炎的新型药物。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章文献综述

1．2金黄色葡萄球菌α-溶血素的Agr调控系统

1．3抗α-溶血素药物

2 百里香酚抑菌作用的概述

2．1百里香酚抗菌活性的研究

2．2百里香酚抑菌机制的研究

2．3百里香酚与其他药物的联合应用

3 研究目的及意义

第二章百里香酚对金黄色葡萄球菌α-溶血素的表达的影响

1 实验材料

1．1菌种

1．2药品和试剂

1．3试剂配制

1．4主要实验仪器

2 方法

2．1细菌培养

2．2最小抑菌浓度的测定

2．3生长曲线的绘制

2．4金黄色葡萄球菌溶血能力的测定

2．5蛋白免疫印迹分析

2．6荧光定量PCR实验

2．7统计分析

3 结果与分析

3．1百里香酚对金黄色葡萄球菌不同菌株的体外抑菌活性

3．2百里香酚在亚抑菌浓度下对金黄色葡萄球菌生长的影响

3．3百里香酚对金黄色葡萄球菌α-溶血素表达的影响

4 讨论

第三章百里香酚对金黄色葡萄球菌α-溶血素介导的A549细胞损伤的保护作用

1 实验材料

1．1菌种和细胞

1．2主要药品和试剂

1．3细胞培养试剂配制

1．4主要实验仪器

2 方法

2．1人肺癌上皮细胞A549的细胞培养

2．2 Live／Dead活死细胞检测试验

2．3乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验

3 结果与分析

3．2百里香酚对金黄色葡萄球菌USA300 α-溶血素介导的A549细胞损伤保护作用的定量分析

4 讨论

第四章百里香酚急性毒性试验研究

1 实验材料

1．1实验动物

1．2主要实验试剂

2 方法

2．1百里香酚的急性毒性试验

2．2统计分析

3 结果与分析

3．1小鼠I临床症状观察

3．2百里香酚通过腹腔注射小鼠的LD50计算

4 讨论

第五章百里香酚对小鼠金黄色葡萄球菌肺炎模型的保护作用

1 实验材料

1．1菌株及实验动物

1．2主要实验试剂

1．3试剂配制

1．4主要仪器

2 方法

2．1金黄色葡萄球菌菌悬液的制备

2．2百里香酚对感染金黄色葡萄球菌小鼠致死性保护率实验

2．3小鼠肺组织切片观察

2．4小鼠湿重／干重(W／D)的测定

2．5肺菌落计数

2．6统计分析

3 结果

3．1百里香酚对小鼠金黄色葡萄球菌肺炎死亡数的影响

3．2百里香酚对小鼠金黄色葡萄球菌肺炎肺脏组织病理学的影响

3．3百里香酚对小鼠金黄色葡萄球菌肺炎湿重／千重(W／D)的影响

3．4百里香酚对小鼠金黄色葡萄球菌肺炎肺脏菌落数的影响

4 讨论

总结

展望

参考文献

致谢

作者简历