表达猪流行性腹泻-轮状病毒的重组伪狂犬病病毒株的构建及部分生物学特性研究

摘要

猪流行性腹泻、猪轮状病毒病与猪伪狂犬病是严重危害养猪业的三种重要传染病，分别由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪轮状病毒(Rotavirus，PoRV)和猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)引起。PEDV和PoRV主要导致仔猪腹泻，PRV则引起母猪繁殖障碍及新生仔猪急性死亡，并伴有呕吐、腹泻、震颤和运动失调等症状。三种病毒常常混合感染导致更大的危害，为了有效预防和控制这三种疾病，研究一种可同时预防这三种疾病的安全、高效的疫苗显得迫切而必须。本项目拟用PoRV VP7和PEDV S基因的免疫优势抗原区域为目标基因，以PRVXJ株作为活载体，同源重组构建表达PEDV S、PoRV VP7的重组伪狂犬病病毒PRV(CM)株，并开展培养特性、遗传稳定性、安全性等生物学特性研究。
　　1 PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S的构建
　　根据已有文献对PEDV S基因和PoRV VP7基因优势抗原表位的研究，结合生物信息学软件分析，参照NCBI上PEDV和PoRV序列分别设计引物S-a/S-b和VP7-a/VP7-b，在引物上下游5'引入合适的酶切位点、保护碱基和柔性肽序列。RT-PCR扩增出部分VP7和S基因作为本研究的候选基因片段，分别克隆至pMD19-T(Simple)，构建pMD-VP7、pMD-S克隆质粒。对pMD-VP7、pMD-S克隆质粒进行KpnⅠ、BamHⅠ双酶切反应，回收目的片段连接转化，构建了重组质粒pMD-VP7.S，对该质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，表明目的基因片段无碱基的突变和缺失，相应酶切位点和柔性肽序列准确引入。对pEGFP-gI28k真核表达载体和pMD-VP7.S重组质粒用XhoⅠ、SalⅠ双酶切，回收目的片段，连接转化，构建含有VP7.S融合基因的PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S，对该质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定。
　　2 表达PEDV S和PoRV VP7基因的重组伪狂犬病毒PRV(CM)株的构建
　　将PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S和伪狂犬野毒株PRV XJ株共转染至293T细胞，通过同源重组构建了共表达VP7和S基因并且gI、gE毒力基因缺失的重组伪狂犬病毒PRV(CM)株，经过PCR、Western-Blotting等鉴定，结果表明VP7和S基因成功表达，重组病毒构建成功。
　　3 PRV(CM)株部分生物学特性研究
　　通过将PRV(CM)接种到BHK-21细胞上，增值特性观察发现VP7.S融合基因片段的插入不影响重组病毒株的增值，测定PRV(CM)的TCID50和亲本株相比较，重组病毒株的增值滴度略有降低;一步生长曲线显示重组病毒株和亲本株具有相似的生长动力学;将PRV(CM)在BHK-21细胞传至20代，各代次病毒增殖规律相似;PCR测定显示外源基因稳定存在，毒力基因稳定缺失;安全性试验结果表明，以不同病毒滴度的PRV(CM)接种哺乳仔猪和怀孕母猪，无临床异常是安全的。

目录

声明

摘要

主要缩略词

第一章文献综述

1猪流行性腹泻病毒

1．1猪流行性腹泻病毒的危害和流行特点

1．2 PEDV的分子生物学

1．3 PEDV疫苗研究进展

2轮状病毒

2．1轮状病毒的危害和流行特点

2．2 RV的病原学特征

2．3 PoRV的分子生物学

2．4 PoRV疫苗研究进展

3病毒活载体疫苗的研究进展

3．1病毒活载体疫苗概述

3．2伪狂犬病毒活载体疫苗

第二章PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S的构建

1材料

1．1菌株、质粒、毒株和细胞

1．2主要试剂

1．3主要仪器

2方法

2．1 PEDV S基因和PoRV VP7基因的扩增

2．2 pMD-VP7、pMD-S克隆质粒的构建

2．3 pMD-VP7.S重组质粒的构建

2．4 pEGFP-VP7.S真核转移载体的构建

3试验结果

3．1 PEDV S基因和PoRV VP7基因的扩增结果

3．2 pMD-VP7、pMD-S克隆质粒的构建结果

3．3 pMD-VP7.S重组质粒的构建结果

3．4 pEGFP-VP7.S真核转移载体的构建结果

4讨论

4．1 PEDV S基因片段和PoRV VP7基因片段的选择

4．2 Linker序列的设计

4．3 PRV转移载体的构建

5小结

第三章表达PEDV S和PoRV VP7基因的重组伪狂犬病病毒株的构建

1材料

1．1质粒、毒株和细胞

1．2主要试剂

1．3主要仪器设备

2试验方法

2．2 PRV和pEGFP-VP7.S质粒DNA的共转染

2．3重组病毒的筛选

2．4重组病毒的空斑纯化

2．5重组病毒的PCR鉴定

2．6重组病毒的Western-Blotting检测

3结果

3．2重组病毒的筛选结果

3．3重组病毒PRV(CM)的PCR鉴定结果

3．4重组病毒PRV(CM)的Western-Blotting结果与分析

4讨论

4．1提高同源重组效率的方式

4．2重组病毒PRV(CM)株的筛选

4．3重组病毒PRV(CM)株的表达

5小结

第四章重组病毒PRV(CM)株部分生物学特性研究

1材料

1．1毒株和细胞

1．2主要试剂和仪器设备

2方法

2．3重组病毒PRV(CM)株和PRV XJ株的TCID50测定

2．4 PRV gB基因荧光定量方法的建立

2．5重组病毒PRV(CM)和PRV XJ株一步生长曲线测定

2．6重组病毒PRV(CM)株遗传稳定性测定

2．7不同代次重组病毒株体外培养各时间点的病毒含量测定比较

2．8重组病毒PRV(CM)的空斑观察

2．9安全性试验

3结果

3．2重组病毒PRV(CM)株在不同细胞上的增值特性观察结果

3．3重组病毒和亲本株的TCID50测定结果

3．4 PRV gB基因荧光定量方法的建立

3．5 PRV(CM)和PRV XJ株一步生长曲线的绘制

3．6重组病毒PRV(CM)遗传稳定性检测结果

3．7不同代次PRV(CM)在各时间点的病毒含量测定结果比较

3．8重组病毒PRV(CM)的空斑形成

3．9重组病毒PRV(CM)安全性试验结果

4讨论

4．1PEDV、PoRV、PRV三价基因工程疫苗的意义

4．2外源基因的插入对伪狂犬病毒增殖的影响

4．3重组病毒部分生物学特性研究

5结论

参考文献

附录

致谢

作者简历