乙型脑炎病毒E-I176R突变位点致弱其神经毒力研究

摘要

乙型脑炎病毒(JEV)是流行性乙型脑炎的病原体。本研究旨在进行JEV关键毒力位点分析、鉴定E-I176R（E蛋白第176位氨基酸由异亮氨酸突变为精氨酸）突变位点能否影响其神经毒力。首先，分析预测了JEV神经毒力相关突变位点6个。在进行了JEV SCYA201201-1与SCYA201201-0901毒株的全基因序列测定的基础上，进行了其神经毒力的鉴定，分析获得了JEV神经毒力相关氨基酸突变位点6个:E蛋白A72T、I176R、S251Y、E273K，NS2B蛋白V44A和NS4A蛋白G168E。其次，成功拯救了JEV E-I176R单点突变病毒。利用定点突变和反向遗传操作方法构建并包装了JEV E-I176R单点突变病毒，利用蚀斑形成试验、PCR、序列测定等方法对包装的病毒进行了鉴定，在BHK-21细胞进行了体外生长特性的研究，发现目标点突变对JEV的蚀斑形成特性与生长曲线没有显著影响。最后，阐明了乙型脑炎病毒E-I176R突变位点能够显著降低其神经毒力。将84只小鼠平均分为14组进行神经毒力实验，每个病毒滴度重复3次进行验证，发现200与2000PFU的未突变病毒引起小鼠的死亡率分别为55.56％与88.89％，而200与2000PFU的E-I176R单点突变病毒引起小鼠的死亡率分别为11.11％与50％。荧光定量检测结果显示，未突变病毒在鼠脑内含量在攻毒后3、5、7天逐渐升高，而E-I176R单点突变病毒在3、5、7天保持稳定。本研究分析出了6个JEV神经毒力相关氨基酸突变位点，证实了E-176为影响乙脑病毒毒力的关键位点，E-I176R单点突变能够能显著降低其神经毒力。本研究为乙脑病毒致弱机制的深入研究奠定了基础。

目录

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摘要

缩略词表

第一部分文献综述

1．2乙脑的分类与分型特征

1．3乙脑的分子生物学特征

2．1反向遗传技术的基本原理

2．2反向遗传技术的应用

研究目的和意义

第二部分试验研究

1．材料

1．1生物材料

1．2主要试剂

1．3主要仪器

2．方法

2．2乙脑E-I176R点突变感染性克隆质粒的构建

2．3乙脑E-I176R点突变病毒的包装

2．4乙脑E-I176R点突变病毒的鉴定

2．5乙脑E-I176R点突变病毒体外生物特性研究

2．6小鼠试验

3．结果与分析

3．1乙型脑炎病毒SCYA201201-1与SCYA201201-0901毒株毒力测定结果

3．2乙脑E-I176R点突变感染性克隆质粒的构建

3．3乙脑E-I176R点突变病毒的包装与鉴定结果

3．4乙脑E-I176R点突变病毒体外生物特性

3．5乙脑E-I176R点突变病毒神经毒力测定结果

4．讨论

4．1 SCYA201201-0901乙型脑炎病毒致弱关键位点分析

4．2点突变乙脑感染性克隆质粒的构建与包装

4．3乙脑E-I176R突变位点影响乙脑病毒生物特性分析

小结

结论

参考文献

致谢

作者简历