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甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)的EST-SSR分子标记和遗传转化研究

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Abstract

摘要

Preface

Chapter Ⅰ Analysis of Microsatellite Markers Derived from Expressed Sequence Tags (EST) of Sweet Potato

1. Introduction

2. Materials and Methods

2.1 Genetic material

2.2 EST-derived primers and reaction condition

2.3 Estimation of polymorphic information content (PIC) and diversity

3. Results

3.1 Transferability and polymorphism

3.2 Cluster analysis involving 52 genotypes

4. Discussion

4.1 Polyploidy of sweet potato

4.2 Transferability and polymorphism of sweet potato EST-SSR

4.3 Application of EST-SSR in the germplasm management

4.4 The limitations of EST-SSR of sweet potato

5. Conclusion

6. References

Chapter Ⅱ Assessment of the Diversity of Sweet Potato by EST-SSR Markers

1. Introduction

2. Materials and Methods

2.1 Genetic materials

2.2 EST-derived primers and reaction conditions

2.3 Gel scoring and data analysis

3. Results

3.1 Regional distribution of allelic diversity

3.2 Cluster analysis

4. Discussion

4.1 Hypothesized origin center of sweet potato

4.2 Prehistoric dispersal of sweet potato

5. Conclusion

6. References

Chapter Ⅲ Establishment of a Rapid, Simple and Efficient Agrobacterium-mediated Transformation Method of Sweet Potato

1. Introduction

2. Materials and Methods

2.1 Plant materials

2.2 Bacterial cultures and plasmids

2.3 Genetic transformation procedure

2.4 Verification of resistance to kanamycin

2.5 Plant DNA isolation

2.6 PCR analysis

2.7 Southern hybridization

2.8 RT- PCR analysis

3. Results

3.1 Organogenesis regeneration of putative transformed events

3.2 Tissue culture-based assay for true transformants

3.3 Molecular characterization of transformed sweet potato plants

3.4 Expression of the nptⅡ gene

4. Discussion

4.1 de novo organogenesis and hormones

4.2 The "escapes" and tissue culture assay

4.3 The new transformation system via de novo organogenesis

5. Conclusion

6. References

ChapterⅣ Somatic Embryogenesis of an Africa Sweet Potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) Variety

1. Introduction

2. Materials and Methods

2.1 Plant materials

2.2 Treatments

2.3 Experiments design

3. Results and Discussion

3.1The statistical analysis of variance

3.2 Effect of eultivar differences

3.3 Effect of auxins on embryogenesis callus formation

4. Conclusion

5. References

ChapterⅤ Agrobacterium-mediated Transformation Efficiency of Some Chinese Sweet Potato Varieties

1. Introduction

2. Materials and Methods

2.1 Plant materials

2.2 Strain

2.3 Plasmid

2.4 Genetic transformation procedure

2.5 Verification of resistance to kanamycin

2.6 Plant DNA isolation

2.7 PCR analysis

3. Results and Discussion

3.1 Transformation efficiency of different sweet potato cultivars

3.2 Kanamycin resistance evaluation of hLFc- transgenic lines

3.3 PCR analysis of transgenic lines

4. Conclusion

5. References

Literature Review: Advance in the Study of Sweet Potato

1. World distribution of sweet potato

2. Botany of sweet potato

3. Diffusing of sweet potato

4. Genebank of sweet potato maintained at CIP

4. Utilization: food, cash, feed and processed products

6. The advance research of EST-SSR markers

7. Genetic transformation and regeneration research in sweet potato

8. References

Acknowledgements

Appendix

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摘要

甘薯(Ipomoea batatas(L.) Lam.)是世界上位列第七位,仅次于小麦,水稻,玉米,马铃薯,大麦和木薯的重要农作物,但该作物的遗传研究却非常少。 首先,保存于国际马铃薯中心(CIP)的甘薯种质资源需要有效的遗传工具去鉴别和评价。另外许多甘薯的基础的问题仍不清楚,如甘薯的起源和驯化的确切中心,该种的祖先种,甘薯是同源多倍体还是异源多倍体,南太平洋群岛的甘薯来源等。 为了解决以上问题,我们构建了一套高信息量且易于鉴别的表达序列标签(EST)-简单重复序列(SSR)分子标记。EST微卫星标记是从甘薯的根和芽的表达序列标签中分离而来。共设计了25对SSR引物,对他们进行了筛选和测试其多态性和可转移性。其中的10对引物显示高质量扩增,高多态性,被用于种质鉴定。9对引物从甘薯和I.trifida中都扩增出了产物,表明SSR的侧翼序列不仅在甘薯(6X)中是保守的,在其近源二倍体中也如此。这9对引物共检测出了66个多态的等位基因,平均每个基因座7.33个。等位基因片段大小从169bp到393bp.相似系数从0.74至0.96。这些EST-SSR多态值从0.4230至0.8718,平均为0.7145.实际杂合度(He)在9个基因座间变动很大,从0.30(IB-S18)至0.99(IB-S10),平均为0.71。 该EST-SSR分子标记被用于对保存于CIP的甘薯基因库中农家种的多样性分析。从南美洲(秘鲁,厄瓜多尔,委内瑞拉和哥伦比亚),中美洲(墨西哥,尼加拉瓜,危地马拉和洪都拉斯)以及南太平洋群岛(巴布亚新几内亚,所罗门,汤加,斐济和库克)收集来的120个农家种进行多样性研究。总等位基因数和每个基因座的等位基因数在地区间分布是不均衡的。聚类分析揭示在中美洲和南太平洋群岛的基因池有很大遗传变异,远大于秘鲁-厄瓜多尔。而危地马拉的农家种与南太平洋群岛群组在一起。 从EST—SSR研究结果表明:1,甘薯是种间杂交的异源六倍体。2,I.trifida很可能是六倍体甘薯起源的二倍体祖先种之一:3,中美洲应该是甘薯起源中心:4,中美洲甘薯应该是南太平洋群岛甘薯的主要来源而不是来自于秘鲁-厄瓜多尔:5,一少部分南太平洋群岛甘薯仍与秘鲁一厄瓜多尔种质群组在一起,暗示了可能存在象“Kumara”假说所说的从秘鲁到南太平洋群岛的史前人类传播。由此可见,EST-SSR可成功应用于甘薯的种质资源管理,如更直接估计功能基因的多态性,基因型鉴定,分类学进化关系的研究。 由于复杂六倍体遗传背景和自交不亲和,使得甘薯基于有性杂交的传统育种非常困难。现代的遗传重组技术给甘薯的遗传改良带来希望。用根癌农杆菌转化甘薯开始于10年前,但高转化效率仍是主要的“瓶颈”问题。因此切需一个全新转化系统来提高转化芽的再生,且该方法应是快速而且基因型不依赖的。 首先研究了一个重要的非洲主栽品种的胚状体途径的再生,该品种在转基因研究中被发现是难于诱导胚性愈伤组织的。诱导条件优化后,在含有激素4-FA的cv.Tanzania的胚性愈伤发生率可达50%.但这些胚性愈伤的再生为植株的频率却低于10%。 我们又对8个中国主栽品种的转化效率进行研究,并试图通过胚状体途径再生转基因植株。用载有pSCL233质粒的根癌农杆菌菌株LBA4404,该质粒有人乳铁蛋白基因,转化甘薯。转化效率在基因型间有显著差异,从0%到69.35%。 PCR确证是转基因。最后,我们成功建立了快速和高效率的根癌农杆菌转化甘薯的新体系。该方法的策略是用甘薯的带叶片的叶柄为外植体,基于转化的分化细胞(de novo)的器官发生途径再生转基因植株。用高毒性的根癌农杆菌菌株EHAl05转化甘薯品种“Jewel”。该菌株内有双元载体pBIN20-D,构建了作为选择标记的nptII基因和过量表达赖氨酸的dhdps-rl基因。转化后4—6周可获得转基因植株。PCR和Southern杂交表明两个基因都整合进甘薯基因组中。反转录PCR研究了nptII基因的表达。所有转基因植株都存活了并移栽到温室。盆栽实验中观察到了正常的形态。 显然,这个可在4—6周获得转基因植株,基于器官发生途径的转基因体系可以适用于遗传改良甘薯。对通过胚状体途径再生困难的品种更为有用。结合转基因植株的叶片抗性组培筛选方法,使大规模获得并筛选遗传改良的甘薯成为可能。

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