创伤性骨关节炎发病机理和初步防治的研究

摘要

研究目的：(1)建立股骨内侧髁不同软骨损伤的实验动物模型，观察不同损伤后关节软骨病理学及生物力学的影响及创伤性骨关节炎的发病机理。 (2)初步探讨关节腔内注射透明质酸钠对关节软骨损伤继发的创伤性骨关节炎的防治作用。 材料与方法：(1)采用自由落体方法，在体内建立由高(6.3J)、低(0.9J)能量撞击造成的兔股骨内侧髁关节软骨不同损伤模型。 (2)选用56只健康成年新西兰大白兔，随机分配到高(6.3J)、低(0.9J)能量撞击组，每组28只，一侧为实验组，另一侧为对照组，术后随机分为4天、1周、2周、4周、8周、16周、32周七个组，每个时间组4只动物。每时间组观察期满后取材，采用HE染色、TUNEL法、扫描电镜、透射电镜、番红0染色、Ⅱ胶原免疫组化、Ⅱ型胶原mRNA原位杂交染色、探针法测定和压凹法测定等方法分别观察不同能量造成关节软骨损伤后软骨细胞凋亡、基质蛋白多糖含量、基质Ⅱ型胶原含量、软骨Ⅱ型胶原mRNA原位杂交染色阳性细胞率和生物力学的变化。 (3)10只健康成年新西兰白兔，双侧均行高能量(6.3J)撞击股骨内侧髁，左侧关节腔内注射透明质酸钠为实验组，右侧关节腔内注射生理盐水做为对照组。每周注射一次，共注射5次。于最后注射时间4周后处死动物，取材。用HE染色、TUNEL法、番红O染色、Ⅱ胶原免疫组化、Ⅱ型胶原mRNA原位杂交染色等方法分别观察软骨细胞的凋亡、基质中蛋白多糖含量、基质中Ⅱ型胶原含量及代谢。 结果：(1)高能量(6.3J)撞击后HE染色病理切片观察，软骨出现裂隙，但未涉及钙化层与软骨下骨，扫描电镜观察，在移形层和辐射层均发现有胶原网架变形并有断裂。低能量(0.9J)软骨无裂隙，细胞层次结构清晰，钙化层紧贴软骨下骨板未见骨折。扫描电镜观察，软骨胶原纤维网架完好，未见变形及断裂。 (2)轻、重组在伤后早期软骨细胞凋亡率明显高于对照组，并具有显著性差异。低能量组中，伤后4周软骨细胞凋亡率恢复到对照组水平。高能量组软骨细胞凋亡率仍逐渐增高，细胞凋亡率与对照组有显著性差异。 (3)结合HE染色与番红O染色结果，低能量组的Mankin评分与对照组标本无显著性差异；高能量组Mankin评分始终较高，与对照组有显著性差异，且Mankin评分呈逐步上升。 (4)低能量组中，伤后早期软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA阳性细胞率增高与对照组有显著性差异。2周后恢复到对照组水平。高能量组中，4天、1、2周的标本软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA阳性细胞率增高与对照组有显著性差异，4周的标本软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA阳性细胞率阳性细胞率下降，随伤后时间越长，软骨细胞陷窝模糊，阳性细胞率越低，与对照组有显著性差异。 (5)低能量组中，Ⅱ型胶原标本着色及基质目标灰度值与对照组无明显差异。高能量组中，4天、1周、2周组软骨基质Ⅱ型胶原目标灰度值与对照组无明显差异；4周后软骨基质Ⅱ型胶原目标灰度值与对照组有显著性差异。 (6)低能量组软骨厚度与对照组相比无明显差异。高能量组4天时软骨厚度就有明显增厚，以后软骨厚度持续上升，4周时达高峰，随后软骨厚度迅速下降，32周时最低。 (7)低能量组中，4天、1周、2周的软骨瞬时剪切模量、平均剪切模量与对照组相比，均有轻度降低，但无显著性差异。以后软骨瞬时剪切模量、平均剪切模量逐渐恢复到正常范围。高能量组中，4天、1、2周时软骨瞬时剪切模量、平均剪切模量均有轻度降低，但无显著性差异。从撞击伤后4周开始，软骨瞬时剪切模量持续迅速下降，8周开始，软骨平均剪切模量也随之迅速下降，且程度相似，32周时最低。 (8)低能量组中，4天、1周、2周的软骨最大压凹回弹率轻度降低，与对照组相比无显著性差异。以后软骨最大压凹回弹率量逐渐恢复到正常范围。高能量组中，4天、1、2周时软骨最大压凹回弹率均有轻度降低，但无显著性差异。从撞击伤后4周开始，软骨最大压凹回弹率持续迅速下降。 (9)高能量(6.3J)撞击关节软骨损伤后，采用关节腔内注射透明质酸钠后，软骨细胞的凋亡率明显下降，Ⅱ型胶原mRNA原位杂交染色阳性细胞率明显升高，软骨基质中蛋白多糖和Ⅱ型胶原浓度均增高。 结论：(1)直接撞击兔的股骨内侧髁造成关节软骨损伤是研究创伤性骨关节炎较好的实验动物模型。 (2)低能量撞击后仅在早期导致关节软骨细胞凋亡率增高，蛋白多糖含量降低，由于软骨胶原纤维网架完好，伤后2周即恢复的对照组水平。软骨Ⅱ型胶原含量、软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA阳性细胞率及生物力学等方面与对照组之间无明显差异。说明关节软骨轻度损伤后具有有限的修复能力。 (3)高能量撞击后由于软骨出现裂隙、胶原纤维网架变形和断裂，随伤后时间延长软骨细胞凋亡率逐渐增高；基质蛋白多糖、Ⅱ胶原含量、Ⅱ胶原mRNA阳性细胞率持续显著下降。软骨瞬时剪切模量、平均剪切模量和最大压凹回弹率持续下降。说明关节软骨重度损伤后不能自行修复。 (4)关节腔内注射透明质酸钠对因撞击伤导致的软骨裂隙、胶原纤维网架断裂和/或变形引起的软骨退变有预防作用。

目录

声明

前言

第一部分：膝关节软骨损伤实验动物模型的建立

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分：撞击后关节软骨退变的病理学研究

实验一：撞击伤后软骨细胞凋亡的研究

材料与方法

结果

结果1.HE染色软骨细胞凋亡率的观测

结果2.TUNEL标记法软骨细胞凋亡率的观测

结果3.透身电镜

结果4.统计学检验

讨论

小结

参考文献

实验二：撞击伤后关节软骨退变的组织学研究

材料与方法

结果

结果1.大体观察

结果2.HE染色组织学观察

结果3.番红O染色\软骨基质目录标灰度值测定

结果4.软骨Mankin法评分

结果5.目标灰度值统计学检验

结果6.软骨Mankin法评分统计学检验

讨论

小结

参考文献

实验三：撞击伤后关节软骨退变中基质Ⅱ型胶原含量及其代谢的研究

材料与方法

结果

结果1.Ⅱ型原免疫组织化学染色,基质目标灰度值测定

结果2.Ⅱ型胶原mRNA原位杂交染色,阳性细胞率测定

结果3.统计学检验

讨论

小结

参考文献

第三部分：撞击伤后软骨退变的生物力学研究

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第四部分：关节内注射透明质酸钠对关节软骨损伤后的影响

材料与方法

结果

1.大体观察

2.软骨细胞凋亡的观察

3.番红染色、软骨基质目标灰度值测定

4.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,基质目标灰度值测定

5.Ⅱ型胶原mRNA原侠杂交染色,阳性细胞率测定

6.统计学检验

讨论

小结

参考文献

结论

综述一：创伤性骨关节炎的发病机理

一、软骨的结构与组成

二、软骨的代谢

三、关节软骨损伤的机理

四、损伤后的软骨改变

五、小结

参考文献

综述二：关节软骨损伤修复研究进展

1.透明质酸与关切软骨损伤的修复

2.磨损关节成形术、软骨下骨微骨折术及钻孔术

3.骨软骨移植术

4.骨膜、软骨膜移植术

5.软骨细胞移植术

6.辅助修复方法

参考文献

致谢