前列腺特异性膜抗原启动子/增强子靶向调控UPRT/5-FU自杀基因系统对前列腺癌作用的实验研究

摘要

目的 本研究通过构建前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子/增强子靶向性调控的尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRT)基因真核表达重组质粒(pPSMApromoter/enhancer-UPRT)，探索pPSMApromoter/enhancer-UPRT/5-FU自杀基因系统对前列腺癌特异的靶向杀伤作用。 方法①首先采用PCR技术，从前列腺癌细胞株LNCaP的总DNA中扩增PSMA启动子和增强子基因序列，分子克隆技术将PSMA启动子增强子基因序列定向插入报告基因表达质粒载体(pEGFP-1)，构建重组质粒pPSMApromoter/enhancer-EGFP。应用PCR技术从大肠杆菌JM109基因组中扩增UPRT基因序列，同样通过分子克隆技术将pPSMApromoter/enhancer-EGFP酶切去除EGFP，连接上UPRT基因，构建PSMA启动子增强子靶向性调控的UPRT基因真核表达质粒pPSMApromoter/enhancer-UPRT。②免疫组化技术检测PSMA在前列腺癌细胞株和非前列腺癌细胞株等不同细胞株的表达。脂质体介导转染重组质粒pPSMApromoter/enhancerEGFP进入前列腺癌细胞株和非前列腺癌细胞株等，通过荧光表达来观察PSMApromoter/enhancer在细胞中靶向调控作用。转染重组质粒pPSMApromoter/enhancer-UPRT和pPSMApromoter/enhancer-EGFP的LNCaP细胞株，加入G418，筛选出稳定表达UPRT基因和EGFP的细胞株。③MTT法检测重组质粒转染肿瘤细胞后，pPSMApromoter/enhancer-UPRT/5-FU基因系统对细胞的生存率变化；FCM检测pPSMApromoter/enhancer-UPRT/5-FU基因系统对细胞增殖周期的改变，并进行细胞凋亡和坏死的测定；5-FU在UPRT催化下直接合成FdUMP和FUTP(F-RNA)，利用HPLC测定细胞外5-FU的含量变化，证明UPRT的功能。④不同比例的转染细胞和非转染细胞混合培养，观察pPSMApromoter/enhancer-UPRT/5-FU基因系统对肿瘤细胞杀伤的旁观者效应。 结果①成功构建重组质粒前列腺特异性膜抗原启动子/增强子靶向性调控的pPSMApromoter/enhancer-EGFP；成功构建前列腺特异性膜抗原启动子/增强子靶向性调控的UPRT基因真核表达质粒pPSMApromoter/enhancer-UPRT，通过测序鉴定，基因序列正确、无缺失和突变。②应用免疫组化技术对多种细胞进行PSMA表达检测，仅有前列腺癌雄激素依赖性细胞株LNCaP的PSMA表达阳性。同时，对这几种细胞株转染靶向性调控的pPSMApromoter/enhancer-EGFP，同样仅有表达PSMA的LNCaP有荧光表达，说明PSMA启动子/增强子对前列腺癌的靶向特异性。③体外表达MTT检测UPRT/5-FU自杀基因系统对细胞存活率影响，直接用药和转染UPRT基因后加入药物均使前列腺癌细胞株LNCaP存活率下降，后者下降要明显，计算IC50，单用5-FU组为UPRT/5-FU系统组的5.5倍。UPRT/5-FU自杀基因系统作用细胞的抑制杀伤效能增强。④FCM检测UPRT/5-FU系统作用引起的细胞凋亡显示：正常细胞组凋亡率为5％，5-FU组为26％～28％，UPRT/5-FU系统组为40％～52％，三组进行两两比较，p均＜0.05，差异有统计学意义。而且，随着5-FU浓度的增加，细胞的凋亡率也增大。细胞增殖周期的检测结果示，LNCaP细胞的G1期明显升高，S期细胞所占比例下降，推断药物5-FU是影响细胞G1向S期的转变，来干扰DNA合成。⑤利用高效液相色谱(HPLC)测定UPRT/5-FU系统作用后细胞外5-FU浓度变化，测得加入药物2h后，转UPRT基因组5-FU浓度下降快于单用5-FU组，随后各组逐渐下降。⑥转染细胞和非转染细胞按照不同比例混合，观察UPRT/5-FU系统旁观者效应(BE)，实验结果该自杀基因系统并没有明显的旁观者效应，随着转染比例的增多，细胞抑制率也逐渐增加，没有出现明显的跳跃性增加。 结论运用分子生物学技术，本研究成功地构建前列腺特异性膜抗原启动子/增强子靶向性调控的UPRT基因真核表达重组质粒pPSMApromoter/enhancer-UPRT，并且在PSMA表达阳性的前列腺癌细胞中特异地转录表达，通过多项实验观察pPSMApromoter/enhancer-UPRT/5-FU自杀基因系统靶向性杀伤前列腺癌细胞，比单一应用5-FU对细胞的杀伤作用明显增强。

目录

声明

英文缩略词表

前 言

第一部分：重组质粒pPSMApromoter/enhancer-EGFP和pPSMApromoter/enhancer-UPRT的构建、鉴定和表达

实验一：重组质粒pPSMApromoter/enhancer-EGFP的构建

1.材料与方法

2.结 果

3.讨 论

4.结 论

实验二：重组质粒pPSMApromoter/enhancer-UPRT的构建

1.材料与方法

2.结 果

3.讨 论

4.结 论

实验三：重组质粒pPSMApromoter/enhancer-EGFP和pPSMApromoter/enhancer-UPRT的鉴定和表达

1.材料与方法

2.结 果

3.讨论

4.结 论

图

第二部分：脂质体介导pPSMApromoter/enhancer-UPRT/5-FU基因系统对前列腺癌细胞的作用研究

1.材料与方法

2.结 果

3.讨 论

4.结 论

图

总结

全文参考文献

文献综述:前列腺癌自杀基因治疗研究进展

攻读硕、博士期间发表或待发表的文章

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