hOGG1基因特异性锤头状核酶体外切割活性及其在A549细胞内瞬时效应的研究

摘要

目的采用分子生物学技术与核酶技术抑制人肺腺癌A549细胞中DNA氧化损伤修复基因人8-羟基鸟嘌呤-DNA糖苷酶(Human8-oxoguanineDNAglycosylase1，hOGG1)的表达，以探讨肺癌的发生与发展同DNA氧化损伤修复基因的关系。 方法运用计算机软件人工设计并合成锤头状核酶基因(Ribozyme，RZ)，将该核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，重组子由BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。多聚酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)扩增锤头状核酶作用的靶基因hOGG1保守序列，将PCR扩增序列插入体外转录载体pBluescriptSK(+)，经SpeⅠ和SacⅡ酶切电泳及测序鉴定。采用地高辛(Digoxigenin，DIG)标记检测系统，体外转录核酶基因及hOGG1基因，获得核酶与带有DIG标记的底物hOGG1mRNA。通过调整核酶体外实验中不同的反应条件，确定核酶体外切割实验方案；然后经RNA变性凝胶电泳分离切割片段，真空转印正电荷尼龙膜固定mRNA，再经DIG的检测系统反映核酶对靶基因的体外切割效率。含有核酶基因的重组载体pcDNA3.1(+)-RZ在类似脂质体的转染试剂FuGENE6的介导下引入人肺腺癌A549细胞，逆转录多聚酶链反应(ReverseTranscriptase-PCR，RT-PCR)扩增耐受新霉素的Neo基因以鉴定阳性转染细胞。以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Humanglyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase，hGAPDH)为内参照，RT-PCR法半定量检测转染细胞中hOGG1mRNA的表达量。以阿霉素为受试物，MTT法检测转染前后细胞存活率的变化，彗星试验检测转染前后细胞DNA氧化损伤修复能力的变化。 结果经酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列成功克隆入pcDNA3.1(+)中，命名为pcDNA3.1(+)-RZ。经酶切电泳及DNA测序证实PCR扩增的hOGG1保守序列成功插入pBluescriptSK(+)，命名为pBluescriptSK(+)-hOGG1。通过尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳及DIG检测系统证实体外成功转录出核酶(RZ)及靶基因hOGG1mRNA。在其它反应条件一定的情况下，选择底物与核酶的摩尔比分别为1：1、1：2、1：4、1：8和1：10；反应温度分别为37℃、42℃和50℃；反应时间分别为30min、60min和90min；缓冲液中Mg2+浓度分别为10mmol/L、15mmol/L和20mmol/L进行核酶的体外切割实验，均未检测出核酶对靶基因具有切割效应。将核酶基因导入A549细胞后，经RT-PCR法鉴定证实重组质粒成功导入靶细胞。半定量RT-PCR法检测出转染核酶的A549细胞中hOGG1mRNA表达量下降36％，与未转染的A549细胞相比有显著性差异(P＜0.05)。选择浓度分别为8.00μg/ml、4.00μg/ml、2.00μg/ml、1.00μg/ml、0.25μg/ml、0.01μg/ml和0μg/ml的阿霉素作用于转染前后的A549细胞，37℃染毒24h，MTT法检测显示在相同浓度的阿霉素作用下，转染核酶基因的A549细胞存活率低于未转染细胞，对阿霉素的敏感性增加；分别于转染后0h、24h和48h，1.0μg/ml阿霉素作用转染前后细胞24h，彗星试验表明在阿霉素作用下，转染核酶的A549细胞较未转染细胞DNA损伤程度增加(P＜0.05)，但无时效关系。 结论成功构建hOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体及含有hOGG1保守序列的体外转录载体。通过调整一系列核酶体外切割反应条件，尚未在体外检测出核酶对靶基因的切割。但核酶在A549细胞内对靶基因具有切割作用，表现为有效抑制靶基因hOGG1的表达，增加了该细胞对抗肿瘤药物阿霉素的敏感性。该结果为进一步研究hOGG1基因的功能及其在肺癌发生机制中的作用奠定了基础。

目录

前言

第一部分：hOGG1特异性锤头状核酶及其靶基因的真核表达载体的构建和鉴定

前言

一 材料和仪器

二 实验方法

三 实验结果

四 讨论

五 小结

第二部分：hOGG1特异性锤头状核酶体外切割效应研究

前言

一 材料和仪器

二 实验方法

三 实验结果

四 讨论

五 小结

第三部分：核酶对细胞内hOGG1基因的抑制效应研究

前言

一 材料和仪器

二 实验方法

三 实验结果

四 讨论

五 小结

结论

参考文献

附录Ⅰ：综述——影响锤头状核酶催化活性的主要因素

附录Ⅱ：中英文词汇对照表

附录Ⅲ：在读期间科研成果简介

致谢