水飞蓟素固体脂质纳米粒的制备及其口服生物利用度、肝靶向性的研究

摘要

水飞蓟素(silymarin，SM)是菊科植物水飞蓟(silybummarianumGaertn)经提取精制成的一种黄酮类有效部位，水飞蓟宾是其主要成分，还含有水飞蓟宁、水飞蓟亭等成分。临床研究表明，水飞蓟素对慢性肝炎、各种肝损伤、肝纤维化和早期肝硬化等肝病等均有明显疗效。但由于水飞蓟素难溶于水，口服生物利用度低，极大的限制了其临床疗效。 课题以山榆酸甘油酯(Compritol888ATO)为载体材料，以大豆磷脂和泊洛沙姆(poloxamer188)为乳化剂，采用高压乳匀法制备了水飞蓟素固体脂质纳米粒(SM-SLN)，以期达到提高SM口服生物利用度，并具备良好的肝靶向性的目的，为此，课题对SM-SLN的物理化学特性、药剂学特性、在大鼠、Beagle犬体内的药动学特征、口服和静注给药途径对其靶向性的影响等进行了系统研究。 以平均粒径、包封率、载药量等为评价指标，考察了将SM制备成PLGA纳米粒、纳米脂质体及SLN三种纳米给药系统的可能性，初步确定以Compritol888ATO-SLN为SM的纳米载体。在对SLN的进一步研究中发现，采用离心超滤法和葡聚糖凝胶柱层析法同时测定SLN的包封率时，得到的测定结果并不完全一致，两者存在一定的差值，而且差值的大小跟SLN的制备工艺密切相关，据此，根据二者测定包封率的原理不同，对采用冷却—匀质法、热融—匀质法制备SLN的载药机制进行了探讨，结果表明，当采用无水乙醇作为分散溶剂时，冷却-匀质法制备的SLN的包封率测定结果分别为：95.5％(离心超滤法)、82.2％(葡聚糖凝胶柱层析法)；热融-匀质法制备的SLN为：99.90％(离心超滤法)、21.53％(葡聚糖凝胶柱层析法)，说明冷压-匀质法制备的SLN以固态溶液的纳米粒为主，而热融-匀质法则形成药物富含于纳米粒外壳的SLN，所以，实验选用冷却-匀质法作为制备方法。 粒径是决定纳米粒在体内吸收程度和靶向性的重要因素之一。当SM-SLN用于口服给药时，首先，需要考虑选择合适的粒径提高药物的生物利用度，其次是粒径对纳米粒肝靶向性的影响。实验考察了150nm、500nm和1000nm三种粒径大小的SLN在大鼠体内吸收的情况，结果三种粒径SLN的AUC分别为7.11、3.41和2.81，因此，选择制备SM-SLN的粒径在150nm左右。 实验采用星点设计-效应面法优化SM-SLN的制备工艺，以粒径、包封率(entrapmentratio，ER％)、载药量(dugloading，DL％)、Zeta电位和表面药物吸附量(M％=ER离心超滤法-ER葡聚糖凝胶柱层析法)为评价指标，为了综合考虑因素对多个指标的综合效果，实验中引入一个综合指标(Overalldesirability，OD)，考察了投料比、乳化剂用量和比例、乳匀压力等四个因素对SLN的制备工艺的影响。各指标与四个因素的关系均可用多元二项式方程来描述，并描绘了指标与因素的三维效应面和等高图，结果表明4个因素对粒径、Zeta电位、M％、OD均有影响，而投料比、乳化剂用量对包封率、载药量影响则较为显著。根据筛选出的最佳工艺制备的SM-SLN粒径、包封率、载药量、Zeta电位和M％分别为151.5nm、88.88％、2.79％，、-21.74mv、10.69％。 以外观、色泽、再分散性等为指标，优选了SM-SLN冻干剂的处方和冻干工艺，解决了SM-SLN长期物理化学稳定性差、不易久贮等问题。冻干过程不影响SM-SLN的稳定性，SM-SLN的粒径、包封率、载药量等其它相关质量指标均未明显改变。吸湿性试验结果表明，SM-SLN冻干剂的临界相对湿度为75.04％，初步稳定性实验显示其稳定性良好。体外释药试验结果表明，SM-SLN冻干剂在生理盐水和PBS(pH=7.4)的释药曲线均可用Weibull模型拟合，与热融-匀质法制备的SLN相比，前期释药有一定量的突释，但后期释药则具有明显的缓释特征。 以利肝隆胶囊、益肝灵片为参比制剂，考察了SM-SLN在大鼠体内生物利用度。采用3p97对测定结果进行处理，确定最佳房室模型，求算药动学参数，结果表明，SM-SLN、利肝隆和益肝灵在体内的药物动力学过程均符合二室模型，对主要的药动学参数进行统计学检验，结果表明，Cmax、AUC、MRT、CLs均有显著性差异(P＜0.01)，SM-SLN在体内的相对生物利用度分别为利肝隆、益肝灵的310％、459％。此外，以益肝灵为参比制剂，初步考察了SM-SLN在Beagle犬体内相对生物利用度，结果表明SM-SLN的相对生物利用度为190％。 选用小鼠为动物模型，考察了口服、静注SM-SLN后，SM-SLN在体内的分布情况，统计学结果表明，口服和静注SM-SLN后，SM-SLN均能显著的提高药物在肝脏中的浓度。为了定量的评价SM-SLN冻干剂的在体内的靶向性，引入以下参数：总体靶向效率(overalltargetingefficiency，TEC)，靶向指数(targetingindex，TIC)，相对总体靶向效率(relativeoveralltargetingefficiency，RTEC)，药物组织分布J等参数。与SM混悬液相比，口服SM-SLN后，在肝脏中的TEC、TIC、RTEC值分别为32.19、7.50、217.01，药物组织分布J提高了1.66倍，药物在肝脏中的MRT提高了1.30倍；与SM溶液相比，静注SM-SLN后，在肝脏中的TEC、TIC、RTEC值分别为63.58、6.60、390.47，药物分布参数J提高了近3倍，药物在肝脏中的MRT提高了7.41倍。实验结果表明，口服、静注SM-SLN后，均可达到良好的肝靶向性，靶器官生物利用度(F=血管外给药靶器官AUC/静注给药靶器官AUC×100％)为39.97％。 本课题首次制备了以Compritol888ATO为载体材料的SM-SLN，所采用制备工艺简便可行，重现性好；冻干后可以增加SM-SLN的长期稳定性，并有利于将其制备成片剂、胶囊剂，丸剂或粉剂等用于口服给药，国内外均未见相关的报道。同时，实验采用单粒子光学传感技术(Singleparticleopticalseasing,，SPOS)对冻干SM-SLN复溶后在1μm～400μm的大粒子数量进行了测定(绝对粒子数)，结果表明冻干SM-SLN也适合于静注给药，为丰富SM的给药途径提供了新的研究思路。 SLN是近年来纳米给药系统中的研究热点，国内外对SLN制备工艺的研究报道较多，但明显缺乏对SLN载药机制和体外释药机制的研究。本课题在国内外对SLN的研究中首次根据离心超滤法和葡聚糖凝胶柱层析法测定纳米粒包封率的不同原理来探讨了SM-SLN的载药机制，并且通过体外释药试验结果进一步确证，实验结果表明制备工艺参数(如温度)与SM-SLN的载药形式有着密切的联系，而SM-SLN的不同载药形式又决定了其在体外的释放曲线，这与Mehnert研究小组通过对SLN的体外释放试验得出的研究结果相吻合，因此，课题的实验设计和方法丰富了关于SLN载药机制和体外释药机制的研究内容。 目前SLN主要被用作静注给药或局部给药，达到靶向、缓释药物或局部治疗的目的，应用于提高难溶性药物的口服生物利用度或通过口服途径达到体内靶向的研究报道较少。在对SM-SLN载药机制的研究基础上，首次探讨了粒径对大鼠口服吸收SLN的影响，系统的研究了SM-SLN在大鼠、Beagle犬体内的生物利用度，为制备新的SM高生物利用度制剂提供了一种新的思路和方法。此外，第一次同时报道了SM-SLN不同给药途径(口服、静注)对靶向性的影响，探讨了通过口服给药达到肝靶向的可能性和影响因素，实验结果达到了预期的课题要求。 课题的研究成果提供了一种新的改善难溶性药物口服生物利用度的思路和方法，同时，丰富了国内外对于SLN的研究内容，为SLN产业化生产和早日走向临床奠定了良好的实验基础。

目录

前 言

第一部分水飞蓟素纳米粒载体材料与制备方法的初步筛选

1仪器与试药

1.1主要仪器

1.2药品与试剂

2方法与结果

2.1体外HPLC测定方法的建立

2.2纳米粒的质量评价方法

2.3水飞蓟素纳米粒载体材料及制备方法的初步筛选

2.4 SLN不同载体材料的筛选

2.5不同高压匀质法对SLN载药方式的影响

3讨论

3.1体外HPLC测定方法的选择

3.2纳米粒载体材料及制备方法的选择

3.3不同高压匀质法对于SLN载药方式的影响

4结论

第二部分水飞蓟素固体脂质纳米粒粒径对口服吸收药物的影响

1仪器与试药

1.1主要仪器

1.2试剂与实验动物

2方法与结果

2.1不同粒径SM-SLN的制备

2.2粒径测定

2.3包封率和载药量的测定

2.4不同粒径SM-SLN制备结果

2.5体外释药特性的研究

2.6 口服不同粒径SM-SLN在大鼠体内吸收的研究

3讨论

3.1制备方法

3.2体外释药规律

3.3体内分析方法

3.4体内SM-SLN的吸收机制

4结论

第三部分水飞蓟素固体脂质纳米粒制备工艺的优化

1仪器与试药

2方法与结果

2.1 SM-SLN制备

2.2 SM-SLN的评价

2.3优化试验

3讨论

4结论

第四部分水飞蓟素固体脂质纳米粒冻干工艺及其体外释药机制的研究

1仪器与试药

2方法与结果

2.1 SM-SLN冻干处方

2.2冻干工艺的建立

2.3 SM-SLN冻干剂的质量评价

2.4 SM-SLN初步稳定性研究

2.5冻干SM-SLN体外释药及其机制的研究

3讨论

3.1冻干处方的研究

3.2冻干工艺的制定

3.3体外释药及其机制的研究

4结论

第五部分口服水飞蓟素固体脂质纳米粒在大鼠和Beagle犬体内的药动学研究

1仪器与试药

1.1仪器

1.2试剂与实验动物

2方法与结果

2.1 SM-SLN在大鼠体内生物利用度试验

2.2 SM-SLN和益肝灵片在Beagle犬体内药动学的初步研究

3讨论

4结论

第六部分口服、静注水飞蓟素固体脂质纳米粒在小鼠体内分布的研究

1仪器、试药与动物

1.1主要仪器

1.2试剂与实验动物

2方法与结果

2.1生物样品中水飞蓟宾的HPLC测定方法

2.2 口服SM-SLN冻干剂小鼠体内分布试验设计

2.3静注SM-SLN冻干剂小鼠体内分布试验设计

2.4生物样品中水飞蓟宾的HPLC测定方法认证结果

2.5口服SM-SLN冻干粉在小鼠体内分布及靶向性试验结果

2.6静注SM-SLN冻干粉在小鼠体内分布及靶向性试验结果

3讨论

3.1关于肝靶向性的评价方式

3.2关于口服靶向性的研究

3.3关于静注靶向性的研究

3.4关于口服、静注SM-SLN两种给药途径的肝靶向性比较

4结论

结 论

主要参考文献

综 述：药物纳米给药系统的研究进展

致 谢

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