一、胰岛β细胞凋亡和功能研究 二、吡格列酮、瑞格列奈、那格列奈治疗对2型糖尿病患者血清游离脂肪酸成分的影响

摘要

目的：观察高脂、高碳水化合物饮食对实验动物胰岛β细胞内过氧化物体增殖物激活受体-α、γ(PPAR-α、γ)和炎性因子表达的影响，及其对β细胞凋亡和功能的影响并探讨相关机理，同时对吡格列酮、非诺贝特干预后药物的作用进行探讨。 方法：建立肥胖大鼠动物模型，雄性S-D大鼠随机分为空白对照组(control)、高脂饮食组[单纯高脂饮食组(fo)、高脂+非诺贝特组(ff)、高脂+吡格列酮组(fp)]、高碳水化合物饮食组[单纯高碳水化合物组(co)、高碳水+非诺贝特组(cf)、高碳水+吡格列酮组(cp)]。干预在第8-10周结束。动物的胰腺组织分别进行组织标本制备、胰岛的分离纯化，HE染色切片上测定胰岛面积；TUNEL检测胰岛细胞凋亡；免疫组织化学、Westernblot检测胰岛中目的蛋白(包括胰岛内分泌激素Insulin、Glucagon、ss；糖、脂代谢重要的调节因子PPAR-α、γ；炎症介质NF-κB、I-κB、P38、ERK1；凋亡调控因子caspase-3)；原位杂交、RT-PCR检测目的核酸水平。 结果：1.co和fo组动物胰岛面积比对照组明显增大，各组间细胞成分无明显差别，co和fo组胰岛素信号明显弱于对照组。吡格列酮使胰岛面积较未用药组明显减小，但使胰岛素的染色强度增强。2.co和fo组胰岛中PPAR-γ、PPAR-α蛋白和mRNA水平比对照组明显减低。吡格列酮使PPAR-γ蛋白和mRNA水平明显升高，非诺贝特使PPAR-α表达水平明显升高。3.高脂组动物胰岛中NF-κB、P38、ERK1蛋白及mRNA表达比正常对照组、高碳水化合物明显增强；非诺贝特能够降低NF-κB、P38的水平，增加I-κB的表达；吡格列酮能降低NF-κB、P38、ERK1的表达水平。4.从对照组、co到fo组，caspase-3蛋白及mRNA水平依次升高，非诺贝特和吡格列酮使co和fo组caspase-3的水平有所下降；各组中胰岛细胞凋亡少见。 结论：在高碳水化合物和高脂饲养造成的胰岛素抵抗模型中，胰岛的面积和胰岛素的储备功能发生了变化，重要的功能分子PPAR-γ、PPAR-α表达异常，多种炎症介质水平增高，凋亡相关蛋白的表达增加，尽管还没有检测到明显的β细胞凋亡和血糖升高，但胰岛细胞内已经存在明显的炎症、凋亡信号调节的紊乱，已明显处于前炎症和前凋亡状态。非诺贝特和吡格列酮能够通过不完全相同的机制，在一定程度上纠正了胰岛功能的异常和炎性介质水平的紊乱，预先保护β细胞。目的：建立铁超负荷的动物模型，观察铁超负荷对实验大鼠糖代谢、胰岛细胞功能及凋亡的影响。 方法：雄性Wistar大鼠随机分为四组：铁干预组(A组)、Na2NTA对照组(B组)、铁干预加去铁组(C组)、空白对照组(D组)，干预持续八周。于实验开始、第5周、第10周时行腹腔注射葡萄糖耐量试验，确定造模成功后采血测血浆NO水平，取胰腺组织做电镜检查；针对PPAR-α、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Caspase-3作免疫组织化学染色以及核酸原位杂交；检测胰岛中Insulin、Glucagon、ss的水平，测定大鼠胰岛面积。分离正常大鼠的胰岛细胞进行FeNTA体外灌注。 结果：实验第10周时，A、C组糖负荷前血糖较B、D组有增高趋势，2小时血糖较B、D组增高；各组间血浆NO含量均在正常范围内，组间差别无统计学意义。电镜示A组大鼠β细胞胰岛素分泌颗粒明显减少，且普遍存在轻-中度的线粒体肿胀、内质网扩张，并出现核膜消失等细胞坏死或坏死前的改变。A组大鼠的胰岛的平均面积明显小于其它组；各组间胰岛细胞的组成没有明显变化；A组中β细胞胞浆中胰岛素的染色强度弱于其他组；体外正常胰岛细胞灌注实验证实FeNTA能导致β细胞的急性分泌功能丧失。A组动物胰岛PPAR-γ蛋白及mRNA表达水平较对照组明显减低，PPAR-α蛋白表达也减低，胰岛中NF-κB、iNOS、Caspase-3蛋白以及NF-κB、Caspase-3mRNA表达水平较对照组有所增加。A组大鼠胰岛β细胞凋亡增加，其他三组中β细胞凋亡少见。 结论：铁超负荷引起明显的氧化-应激，NF-B以及iNOS等炎性细胞因子激活，具有抗炎作用以及促生长作用的PPAR-γ和PPAR-a在胰岛的表达减弱，多种因素共同参与了β细胞的凋亡增加。胰岛β细胞凋亡可能是铁超负荷组动物胰岛细胞团面积减少、糖耐量受损的主要原因；铁在体内的致凋亡作用是通过凋亡调控分子Caspase-3介导的；去铁措施对β细胞具有明显的保护作用。目的：1、比较2型糖尿病患者和非糖尿病的健康人之间血清游离脂肪酸(FreeFattyAcid，FFA)中各种成分的水平。2、观察匹格列酮、瑞格列奈、那格列奈药物治疗对2型糖尿病患者血清游离脂肪酸成分的影响。 方法：征集25例糖耐量正常者作为对照组，符合1999年WHO诊断标准的2型糖尿病患者65例，对匹格列酮组(25例)进行了为期一年的观察。而对40例2型糖尿病患者随机分为瑞格列奈组(18例)、那格列奈组(22例)进行治疗，治疗前2周为平衡期，疗程3月。采用改进的高效液相色谱RHPLC法检测各组患者治疗前、治疗后晨空腹血清游离脂肪酸的主要成分(月桂酸、豆蔻酸、花生四烯酸、亚油酸、软脂酸、油酸、硬脂酸)水平并比较。匹格列酮组患者继续治疗至1年后再次测定空腹血清游离脂肪酸的成分。 结果：(1)2型糖尿病患者血清中的月桂酸、豆蔻酸和硬脂酸的水平比正常对照明显升高(P＜0.05)。(2)吡格列酮治疗3月后血清FFA总浓度(TFA)下降、血清中主要的饱和脂肪酸豆蔻酸、软脂酸、硬脂酸的浓度比治疗前明显降低(P＜0.001)，不饱和脂肪酸(UFA)与饱和脂肪酸(SFA)的比值(UFA/SFA)明显升高；治疗1年后的数据显示：饱和脂肪酸水平进一步降低，不饱和脂肪酸油酸、亚油酸的水平也有显著下降(P＜0.005)；UFA/SFA的比值恢复至治疗前的水平。(3)瑞格列奈治疗3月后糖尿病患者血清总FFA浓度无明显下降，检测的七种游离脂肪酸成分的浓度较治疗前均有轻度下降，但无统计学意义(P＞0.05)；那格列奈治疗3月后，月桂酸有一定程度下降，但无统计学意义，而豆蔻酸、软脂酸的水平较治疗前升高，具有统计学意义(P＜0.05)；UFA/SFA的比值在瑞格列奈治疗前后变化不大，在那格列奈治疗后明显降低。两种药物作用比较发现瑞格列奈与那格列奈两种药物对豆蔻酸、亚油酸、软脂酸三种主要成分以及TFA、SFA的总量的影响具有显著差异，对SFA/TFA、UFA/TFA以及UFA/SFA在血清中的比例都没有明显影响。 结论：匹格列酮治疗可以明显降低2型糖尿病患者血清游离脂肪酸的水平，改变脂肪酸的成分，其治疗初期以降低饱和脂肪酸为主，UFA/SFA明显增高；长期治疗可以使血清中不饱和脂肪酸的水平降低，但UFA/SFA水平与治疗前一致，并未下降。瑞格列奈治疗具有轻度的降低血清脂肪酸水平的作用；那格列奈治疗后可使血清中月桂酸有一定程度的下降，但豆蔻酸和软脂酸水平明显升高，有关临床意义尚待阐明。

目录

声明

一胰岛β细胞凋亡和功能研究

第一部分高脂、高碳水化合物饮食对大鼠β细胞凋亡和功能的影响以及吡格列酮、非诺贝特的作用

摘要

前言

材料与方法

结果(一)

结果(二)

讨论

结论

第二小部分铁超负荷对大鼠胰岛β细胞凋亡和功能的影响

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

二匹格列酮、瑞格列奈、那格列奈治疗对2型糖尿病患者血清游离脂肪酸成分的影响

摘要

前言

对象与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 铁与糖尿病关系研究进展

参考文献

致谢