兔实验性颈动脉瘤模型的建立及MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2在模型中的表达研究

摘要

一、研究背景和目的：脑动脉瘤(aneurysm，AN)是自发性蛛网膜下腔出血最常见的原因之一，其破裂出血的发病率在脑血管疾病中占第三位，仅次于脑血栓形成和高血压脑出血，其出血后第一个月的死亡率可高达近50％。研究AN的发病机制对于预防AN的形成、控制AN的扩大、破裂、改善AN的预后都会有很大帮助。如何建立理想的AN动物模型，是开展此类研究的难点和关键。目前脑AN制作的方法很多，主要有外科手术法、介入制作法、血流动力学和药物诱导法等。这些方法所制作的AN模型离理想的AN模型尚有一定差距。弹力蛋白酶(elastase，EA)动脉外壁滴注所诱发的AN与人脑AN病理改变基本一致，其方法简单，容易重复，成本低廉。但目前对所使用的EA溶液的浓度、量，结扎一侧颈总动脉对AN形成情况的影响，AN形成早期的形态学变化，AN形成后的长期效果尚不太清楚和有一定争议。探讨合适的经动脉外壁滴注的EA溶液的浓度、量，结扎一侧颈总动脉(commoncarotidartery，CCA)对AN形成情况的影响，AN形成早期的形态学变化，AN形成后的长期效果，为进一步探讨AN的发病机制和治疗措施打下基础。 方法：①新西兰白兔12只，雌雄各半，随机分成4组，测量颈外动脉与CCA分叉处近端0.5mm处及其沿CCA近心方向各相隔1cm的4点的血管直径；双侧分次分别滴注0.5u/μl、1.0u/μl、1.5u/μl、3.0u/μl的EA溶液1μl，每次滴注0.5μl，观察5分钟～1小时的动脉壁直径变化。②新西兰白兔12只，雌雄各半，随机分成4组，分别于双侧滴注1.5u/μl的EA溶液1.0μl和分次滴注0.5μl，1.0μl，2.0μl，每次0.5μl，观察5分钟～1小时对血管直径和形状的影响。③新西兰白兔42只，雌雄各半，随机分成5组，即对照组A(6只)、对照组B(6只)、实验组C(12只)、实验组D(12只)，实验组E(6只)。每组一半于术时结扎一侧CCA，实验组于CCA分两次滴注1.5u/μl的EA溶液1μl，对照组于CCA滴注1μl生理盐水。A、C组于术后1天，B、D组于术后第7天取AN送病理检查，行HE和Weighter染色，并观察兔的术前、术后1天、术后7天的基本生命体征变化、动脉直径变化、血管通畅情况。E组连续观察2个月，取其中2只解剖颈部，观察AN处血管壁和血管通畅情况。 结果：①滴注不同浓度的EA溶液在术后动脉直径比较时差异有统计学意义，1.5u/μl诱导的血管的直径最大；在1.5u/μl组中，5分钟～1小时比较，动脉直径的差异有统计学意义，30分钟和1小时时的动脉直径最大。30分钟和1小时时的动脉直径比较差异无统计学意义。②滴注不同的EA溶液的量在术后30分钟时动脉直径比较，各组间差异有统计学意义，0.5μl组的动脉直径较小，其余3组间差异无统计学意义。但梭形AN数在分次滴注1.0μl组为2/6，在分次滴注2.0μl组为4/6，在一次滴注1.0μl组为5/6个。③使用1.5u/μl的EA溶液1μl分两次在兔CCA外滴注成功的诱导了兔颈总AN，我们在30只兔子的CCA上诱导成功45个AN，其中侧壁囊性AN36个，梭形AN9个。手术前后兔的基本生命体征之间的差异无统计学意义，无1例兔于术后死亡。④结扎兔的一侧CCA，对兔的系统血压和AN形成的高度、宽度的影响和未结扎组的差异无统计学意义。⑤病理检查示术后第1天虽有弹力纤维的明显破坏，但并未完全消失，平滑肌层基本完整，外膜有较多炎症细胞浸润。在术后第7天局部弹力纤维基本完全消失，平滑肌层明显降解。对照组也有炎症细胞浸润，但在随后未观察到弹力纤维降解、平滑肌退行性变。⑥在成瘤后2个月的观察过程中，未发现AN模型的自发性破裂，解剖2只兔的颈部，见血管腔保持通畅，AN的高度分别为3.82和4.01mm，宽度分别为2.79和2.98mm，和术后7天相比无明显变化，但局部管壁发白，炎症增生明显。⑦颈外动脉与CCA分叉处近端0.5mm处及其沿CCA近心方向各相隔1cm的4点的血管直径的差异无统计学意义。 结论：①使用1.5u/μl的EA溶液1μl分两次在兔CCA外滴注诱导AN是我们认为的较适合的浓度和量。②EA颈总动脉外滴注所诱导的兔颈总AN模型是一种较为成功的AN模型，其方法简单，容易重复。AN从形成到稳定仅约30分钟，手术时间短，对兔的生理功能干扰小，术后的死亡率极低。病理检查具有典型的AN形态学特征，可以用于研究AN形成、扩大的原因，也可用于介入治疗材料的研究，为AN的治疗和发病机制的研究提供帮助。③动脉壁弹力纤维的破坏是AN形成的始动因素，炎症细胞浸润加剧了血管基质和平滑肌的退行性变，导致血管壁的进一步扩张、变薄。应用抑制EA活性和炎症细胞浸润的药物，可以用于治疗和预防AN。④结扎一侧CCA并非是诱导AN模型的必要条件。⑤单纯用EA诱导的AN模型和真实情况有一定差异，未发现AN有增大趋势和自发性破裂，局部炎症反应较重。⑥EA颈总动脉外滴注的部位可选用兔环状软骨平面处，此处位置表浅，操作方便。 二、研究背景和目的：许多研究表明，细胞外基质(extracellurmatrix,ECM)的改变和脑动脉瘤(aneurysm，AN)形成相关。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)是一组Zn2+依赖性蛋白酶，其主要功能是降解和重塑ECM,在正常的胚胎发育和组织重塑等生理过程以及一些疾病的病理生理中起重要作用。组织基质金属蛋白酶抑制剂(tissueinhibitormetalloproteinases,TIMPs)在ECM代谢中起着与MMP对应的负性调节作用，可阻止MMP的活化和其作用，影响蛋白分解损伤的程度和持续时间。在一些基质降解过度的疾病,MMP和TIMP之间平衡常失调，导致MMP活性总体上净增加。探讨AN中MMP和TIMP表达情况，将有助于对AN发病机制和药物治疗的研究。目前对脑AN中，尤其是AN形成早期的MMPs和TIMPs的变化研究较少。我们探讨了MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2在AN模型中早期的表达差异，并结合形态学变化，探讨MMP和TIMP在AN形成早期的作用，为进一步探讨动脉瘤的发病机制和治疗措施打下基础。 方法：取在第一部分实验中做的石蜡标本，共5组，即正常血管、对照组术后1天、对照组术后7天、滴注EA组术后1天和滴注EA组术后7天，每组取6个蜡块，连续切片。用免疫组化的方法对各组中MMP-1、MMP-2、MMP-9和TIMP-2的早期表达情况进行研究。 结果：①正常组动脉壁组织MMP-1蛋白表达为阴性。术后第1天动脉壁组织MMP-1主要表达于内膜侧，染色浅到中。术后第7天动脉壁组织由于管壁变薄，细胞成分明显较少，MMP-1未见明显表达，在炎症细胞浸润和血栓形成的区域可见MMP-1表达。实验组和对照组比较，术后第1天差异无统计学意义，术后第7天差异有统计学意义，对照组高于实验组。在对照组中，术后1天和7天MMP-1的表达差异无统计学意义，在实验组中术后1天和7天MMP-1的表达差异有统计学意义，术后1天的表达高于术后7天。②正常组动脉壁组织MMP-2蛋白表达为弱阳性，以内膜和外膜为主，中膜有少量表达。术后第1天MMP-2表达以内膜处明显，基质和外膜中有少量表达，实验组和对照组比较差异有统计学意义，实验组高于对照组。术后第7天MMP-2在血管壁全层都有表达，实验组和对照组比较差异有统计学意义，实验组高于对照组。在对照组中，术后1天和7天MMP-2，的表达差异有统计学意义，术后7天的表达高于术后1天。在实验组中术后1天和7天MMP-2的表达差异有统计学意义，术后7天的表达高于术后1天。③正常组动脉壁组织MMP-9蛋白表达于动脉全层，以内弹力膜附近明显。术后第1天表达以内膜处为主，基质和外膜都有表达，实验组和对照组比较差异无统计学意义，术后第7天表达于动脉全层，以内弹力膜附近明显，实验组和对照组比较差异无统计学意义。在对照组中，术后1天和7天MMP-9的表达差异无统计学意义，在实验组中术后1天和7天MMP-9的表达差异无统计学意义。④正常组动脉壁组织TIMP-2蛋白表达于动脉全层，以内弹力膜附近明显。术后第1天TIMP-2在血管壁内层有表达，以内膜为主，实验组和对照组比较差异有统计学意义，对照组高于实验组；术后第7天实验组未见明显表达，实验组和对照组比较差异有统计学意义，对照组高于实验组。在对照组中，术后1天和7天TIMP-2的表达差异无统计学意义，在实验组中术后1天和7天TIMP-2的表达差异有统计学意义，术后1天的表达高于术后7天。 结论：①在AN形成的初期，MMP-2/TIMP-2的比率增加，可能是AN发生弹力纤维的进一步降解和平滑肌凋亡的主要原因，使用抑制MMPs活性，尤其MMP-2的活性的药物，可能抑制AN的进一步扩张、破裂的发生。②MMP-1和MMP-9在动脉瘤形成的早期的作用并不明显。③内皮细胞破坏，MMP-1的减少可能是AN模型不发生自发性破裂的原因之一。

目录

第一部分弹力蛋白酶滴注法诱导兔颈总动脉瘤模型及其形态学变化

前言

材料和方法

结果

附图

讨论

结论

参考文献

第二部分MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2在兔实验性颈总动脉瘤模型表达研究

前言

材料和方法

结果

附图

附图

讨论

结论

参考文献

综述一：弹性蛋白酶诱导制作动脉瘤模型的进展

综述二：MMPs、TIMPs在动脉瘤中的表达及其作用研究进展

致谢

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