实验性兔脑动脉瘤模型的建立及NF-κB、MCP-1和MMP-9在模型中的表达及机制探讨

摘要

第一部分：
　　 研究背景及目的:颅内动脉瘤(aneurysm,AN)破裂是自发性蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)最主要的因为。虽然大量流行病学发现高血压、糖尿病、吸烟、饮酒等因素是颅内动脉瘤的危险因素,但是其发生、生长和破裂的机制还不清楚。探讨动脉瘤的形态、发病机制、演变过程对临床治疗具有重要意义,这些研究都依赖于建立可信的动脉瘤模型。目前动脉瘤动物模型建立方法主要有静脉移植法、动脉局部结构破坏法和动脉移植法、改变血液动力学方法和血管内介入法。然而这些方法所制作的动脉瘤模型离理想的动脉瘤模型尚有一定的差距。近些年来关于弹性蛋白酶(elastase,EA)滴注诱导实验动物动脉瘤模型的研究愈来愈多,该方法简单,容易重复,成本较低。但目前对弹性蛋白酶诱导的动脉瘤模型,在形态学和早期的病理变化方面还缺少可靠的依据,本研究的目的是用弹性蛋白酶诱导的动脉瘤模型进行形态学观察和病理变化研究,为进一步探讨脑动脉瘤的发病机制和治疗措施提供依据。
　　 方法:(1)新西兰白兔24只,雌雄各半,随机分成4组,A组(对照组)；B组(一周组)；C组(两周组)；D组(三周组),每组6只。(2)游标卡尺测量距右颈内外动脉分叉处近端约0.5cm~1.0cm颈总动脉(common carotid artery,CCA)直径,手术显微镜下轻轻撕去该部表面的纤维结缔组织,抽取50u/ml的弹性蛋白酶0.2ml滴注其表面,对照组用PBS滴注,20min后通过兔耳缘静脉缓慢推注肝素纳500u。(3)一周后CT血管造影(CTA)分别检测对照组和实验组兔右侧颈总动脉滴注局部血管形态变化和动脉瘤形成情况。(4)从手术日起每隔一周处死兔6只,处死前测量动脉瘤的颈宽、瘤高,取下颈总动脉瘤标本,一部分用于HE染色和免疫组织化学染色,另一部分用于实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测。(5)动脉瘤标本进行HE染色和光镜检查。
　　 结果:一周后实验兔行CTA检查,18只实验兔均发现作用血管段形成明显的梭形或囊性动脉瘤,其中可见血栓形成,并且血管有闭塞现象,对照组未发现动脉瘤样病变。病理检查提示,实验组动脉瘤瘤壁变薄,弹性纤维断裂,最终消失,平滑肌细胞减少萎缩,降解明显,对照组也有少量炎性细胞浸润,但未观察到弹力纤维降解和平滑肌退行性变。
　　 结论:弹性蛋白酶滴注诱导兔颈总动脉能产生明显的梭形或囊性动脉瘤,该方法简单,成本较低,容易重复,病理检查具有典型的动脉瘤形态学特征,更接近于临床上人的动脉瘤,可以用于动脉瘤的病因和治疗方面的研究,为动脉瘤的进一步研究提供了良好的实验基础。
　　 第二部分：
　　 研究背景及目的:脑动脉瘤是常见的脑血管病之一,其发病率成逐年增高的趋势,已受到越来越多学者的关注,但是其发生,发展机制仍然有待于进一步研究。近年来关于炎症及细胞外基质酶系参与动脉瘤形成过程的研究越来越深入,大量的国内外研究表明,慢性炎症及动脉壁细胞外基质的病理性重构可能是动脉瘤发生发展的重要机制。腹主动脉瘤的研究表明,各种炎性细胞的浸润促进了基质金属蛋白酶(MMPs)的分泌,尤其是MMP-9的分泌,导致动脉管壁弹力纤维和胶原纤维的损伤而发病,已成为国内外学者可以广泛接受的观点,在浸润的炎性细胞中,以巨噬细胞的作用最为突出,而单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)对巨噬细胞的浸润有着重要的调节作用,核转录因子(nuclear factor-κB,NF-κB)则在转录水平调控了MCP-1等促炎症基因的表达。但目前对NF-κB、MCP-1和MMP-9与脑动脉瘤发生生长的炎症机制的关联研究尚少,有待进一步研究。我们拟借助动物模型,对动脉瘤壁中NF-κB、MCP-1和MMP-9的早期动态表达情况进行研究,同时结合目前的研究现状探讨其可能发病机制,为深入研究动脉瘤的炎症机制提供良好的实验依据。
　　 方法:取第一部分各实验组动脉瘤和正常对照组石蜡标本,每组取6个蜡块,连续切片,用免疫组织化学的方法对NF-κB、MCP-1和MMP-9蛋白表达情况进行研究。另取第一部分各实验组动脉瘤和正常对照组冷冻标本进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR),检测NF-κB、MCP-1和MMP-9 mRNA表达情况。
　　 结果:(1)免疫组化结果显示:NF-κB一周组、两周组、三周组与对照组相比,p值分别为<0.001,<0.001,0.348；其中一周组与两周组相比,差异无显著性(p=0.516)。
　　 MCP-1一周组、两周组、三周组与对照组相比,p值均<0.05；其中一周组与两周组相比,差异无显著性(p=0.367)。
　　 MMP-9表达呈逐渐增高趋势,各组间比较差异均具有显著性(p值均<0.05)。
　　 结果表明,NF-κB和MCP-1对照组未见表达,实验组于1周时表达达高峰,3周时均仅见少量表达,阳性表达主要位于平滑肌细胞、内皮细胞和炎性细胞；MMP-9表达则呈逐渐增强趋势,动脉瘤壁全层均可见表达,瘤壁破坏严重。
　　 (2)Real-time PCR检测结果提示:NF-κB一周组、两周组、三周组与对照组相比,p值分别为0.041,0.008,0.558；其中一周组与两周组相比,差异无显著性(p=0.317)。
　　 MCP-1一周组、两周组、三周组与对照组相比,p值分别为0.001,0.006,0.056:其中一周组与两周组相比,差异无显著性(p=0.124)。
　　 MMP-9表达呈逐渐增高趋势,各组间比较差异均具有显著性(p值均<0.05)。
　　 结论:(1)NF-κB在脑动脉瘤瘤壁炎症反应及血管壁病理变化过程中发挥着重要作用,NF-κB的活化可能是脑动脉瘤发生与发展的始动因素之一。
　　 (2)MCP-1基因作为早期表达基因,其表达产物诱导了单核巨噬细胞在动脉壁的粘附、浸润,进一步使动脉壁弹力纤维降解,促进了脑动脉瘤的发生、发展。
　　 (3)弹力纤维的破坏是脑动脉瘤形成的关键的因素之一,炎性细胞的浸润及MMP-9分泌的增多则是引起弹力纤维破坏的主要因为。