菠菜种子胰蛋白酶抑制剂分离纯化与性质研究

摘要

蛋白酶抑制剂是一类能选择性地降低靶蛋白酶活性的小分子量蛋白质。植物蛋白酶抑制剂参与了植物内源性蛋白酶活力的调节、植物贮藏蛋白的运输、保护植物免受真菌和昆虫的侵蚀，作为抗虫因子，已广泛地应用于抗虫转基因植物的选育。而且蛋白酶抑制剂作为新型药物在癌症、艾滋病等疾病的治疗方面具有应用价值。我们从菠菜种子中分离纯化得到胰蛋白酶抑制剂SOTI，对其进行了部分性质研究。藜科菠菜属植物菠菜(SpinaciaoleraceaL)种子研磨粉碎后，经过乙醚脱脂、pH4.5的硫酸抽提、65℃热变性除杂蛋白、35-75％饱和度硫酸铵分部盐析等步骤，得到抑制剂粗提物。进一步利用DEAE-52纤维素离子交换柱层析，胰蛋白酶—Sepharose4B以及G75葡聚糖凝胶过滤，最后从粗提液中分离纯化得到其中的胰蛋白酶抑制剂(SOTI)。SDS-PAGE分析其近似分子量为22kD。等电聚焦实验显示其等电点为4.02。热稳定性实验显示SOTI在100℃水浴条件下可以保持部分的抑制活性，具有极高的热稳定性。　　利用蛋白质内源荧光检测SOTI在不同溶液中的构象变化。抑制动力学实验证明：SOTI为单头抑制剂，抑制类型为竞争性抑制，抑制常数远小于胰蛋白酶的反应常数，是一种抑制活力很强的抑制剂。SOTI具有276nm最大吸收，表明SOTI中含芳香族氨基酸残基。

目录

摘要

引言

1材料和方法

1.1材料与仪器

1.2实验方法

1.2.1固相化胰蛋白酶的制备

1.2.2菠菜种子胰蛋白酶粗提物的制备

1.2.3菠菜种子胰蛋白酶抑制剂的纯化

1.2.4胰蛋白酶抑制剂活力的测定

1.2.5蛋白质浓度的测定

1.2.6 SOTI纯度的鉴定(SDS-PAGE)

1.2.7热稳定性分析

1.2.8天然等电聚焦(IEF)电泳

1.2.9变性剂对SOTI活性的影响

1.2.10变性剂作用下SOTI的荧光光谱分析

1.2.11 pH对SOTI抑制活性的影响

1.2.12 SOTI抑制类型和抑制常数Ki值的测定

1.2.13 SOTI对胰蛋白酶的抑制能力（抑制摩尔比）的测定

1.2.14 SOTI紫外吸收光谱

2结果

2.1固相化胰蛋白酶亲合层析柱的制备

2.2胰蛋白酶抑制剂粗提物的制备

2.3 SOTI的分离纯化

2.4 SOTI的纯化各步骤纯度鉴定SOTI的分子量测定

2.5 SOTI的热稳定性

2.6 SOTI的等电点

2.7变性剂对SOTI活性的影响

2.8变性剂作用下SOTI的荧光光谱

2.9不同pH对SOTI抑制活性的影响

2.10 SOTI抑制类型和抑制常数Ki值的测定

2.11SOTI对胰蛋白酶的抑制能力(抑制摩尔比)的测定

2.12 SOTI紫外吸收光谱

3 讨论

3.1固相化胰蛋白酶的制备(亲合层析胶体制备)

3.2胰蛋白酶抑制剂粗提物的制备

3.3 SOTI的分离纯化

3.4 SOTI的热稳定性

3.5 SOTI的等电点测定

3.6变性剂对SOTI活性和荧光光谱的影响

3.7pH对SOTI抑制活性的影响

4结论

参考文献

综述 植物蛋白酶抑制剂——植物生理调节过程中的多功能蛋白

参考文献

致谢

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