重组人p53腺病毒基因药物（rAd/p53）诱导人鼻咽癌、喉癌细胞凋亡和生长抑制的实验研究

摘要

目的：1、进行人鼻咽癌细胞CNE、喉癌细胞Hep-2体外培养。2、用MTT实验、免疫组化实验、流式细胞仪实验研究不同浓度腺病毒介导p53基因(rAd/p53)诱导人鼻咽癌细胞CNE、喉癌细胞Hep-2凋亡及抑制肿瘤细胞生长的作用。 方法：1、进行人鼻咽癌细胞CNE、喉癌细胞Hep-2体外培养，传代2次。2、将rAd/p53配制为不同浓度：10<'10>、10<'9>、10<'8>、10<'7>。3、将肿瘤细胞接种于Falcon96孔培养板，每孔均匀接种100μl(2.5×10<'3>细胞)，置37℃，5％CO2，100％饱和湿度孵箱内培养过夜。实验组加入不同浓度的rAd/p53，对照组不加rAd/p53。置37℃，5％CO2，100％饱和湿度孵箱再培养6天。每天取1块96孔培养板，用MTT法每天测定培养的实验组及对照组肿瘤细胞的OD值，观察培养期间细胞生长情况。连续6天。选择10<'10>rAd/p53作为最佳浓度进行以下实验。4、将肿瘤细胞以每孔5x10<'4>个细胞接种于放有盖玻片的6孔板中，每孔体积2ml。将培养板移入CO<,2>孵箱中，37℃，5％CO<,2>及100％饱和湿度下，培养24小时。实验组加入不同浓度的10<'10>rAd/p53，并另设不加rAd/p53的阴性对照组，继续培养6天。每天取1块6孔培养板，取出附有肿瘤细胞的盖玻片，制成爬片。分别于培养的2，3，4，5天，用免疫组化检测实验组中突变型p53蛋白表达；及于培养的5天，用免疫组化检测对照组中突变型p53蛋白表达。5、将肿瘤细胞接种于T100培养瓶中，每瓶体积5ml。将培养瓶移入CO<,2>孵箱中，37℃，5％CO<,2>及100％饱和湿度下，培养24小时。实验组加入10<'10> rAd／p53，并另设不加rAd/p53的阴性对照组，继续培养6天。分别于培养的3，4，5天用流式细胞仪分析实验组细胞周期分布和凋亡率。于培养的5天，用流式细胞仪分析对照组细胞周期分布和凋亡率。 结果：1、MTT实验中，实验组及对照组的细胞数随培养时间的延长均增加。实验组细胞数于培养第4天始较对照组细胞数减少。实验组及对照组随培养时间的延长OD值均增加。CNE组：10<'10> rAd／p53实验组于培养第4天始OD值较前3天明显减少。(P<0.05)。10<'9>rAd／p53实验组于培养第5天始OD值较前4天明显减少。(P<0.05)。10<'8>rAd／p53实验组、10<'7>rAd／p53实验组OD值随培养时间的延长无明显减少。(P>0.05)。对照组随培养时间的延长OD值增加。(P<0.05)。即10<'10> rAd／p53、10<'9>rad／p53有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用。实验组与对照组OD值在第4、5、6天同一时间点有统计学差异(P<0.05)。实验组与对照组OD值在第1、2、3天同一时间点无统计学差异(P>0.05)。即rAd／p53于培养第4天始有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用。Hep-2组：10<'10> rAd/p53实验组于培养第4天始OD值较前3天明显减少。(P<0.05)。10<'9>rAd／p53实验组、10<'8>rAd/p53实验组OD值随培养时间的延长无明显减少。(P>0.05)。10<'7>rAd／p53实验组、对照组随培养时间的延长OD值增加。(P>0.05)。即10<'10> rAd/p53有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用。实验组与对照组OD值在第3、4、5、6天同一时间点有统计学差异(P<0.05)。实验组与对照组OD值在第1、2天同一时间点无统计学差异(P>0.05)。即rAd／p53于培养第3天始有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用。2、免疫组化检测中：CNE实验组：培养第2，3，4，5天突变型p53表达阳性的阳性细胞数分别为：95％， 94.64％，75％，0。阴性对照组培养第5天时突变型p53表达阳性的阳性细胞数为97.06％。Hep-2实验组：培养第2，3，4，5天突变型p53表达阳性的阳性细胞数分别为：24.49％，19.15％，5.57％，0。阴性对照组培养第5天时突变型p53表达阳性的阳性细胞数为83.33％。可见CNE、Hep-2组：实验组突变型p53蛋白表达阳性的阳性细胞数随培养时间的延长有递减趋势。(P<0.0001)。培养第5天时实验组突变型p53蛋白表达阳性的阳性细胞数远低于阴性对照组。(P<0.0001)。3、流式细胞仪实验中，CNE组：实验组第3、4、5天时凋亡率为64.5％、92.5％、99.1％。第3天时S期增埴为29.3％，第4、5天时S期增埴因细胞凋亡而不能测出，可见凋亡碎片。对照组第5天时凋亡率为4％，S期增埴为28.5％。Hep-2组：实验组第3、4、5天时凋亡率为18.1％、70.6％、69.8％。第3天时S期增埴为28.6％，第4、5天时S期增埴因细胞凋亡而不能测出，可见凋亡碎片。对照组第5天时凋亡率为2.1％。S期增埴为36％。可见CNE、Hep-2组：实验组凋亡率随培养时间的延长有递增趋势。(P<0.0001)。培养第5天时实验组凋亡率远高于阴性对照组。(P<0.0001)。 结论：腺病毒介导p53基因(rAd/p53)具有良好的抑制鼻咽癌细胞CNE细胞、喉癌细胞Hep-2增殖作用及诱导凋亡的作用。为喉癌、鼻咽癌的治疗提供了临床前依据。

目录

论文说明：中英文对照缩写词表

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前言

第一部分人鼻咽癌细胞CNE、喉癌细胞Hep-2的体外培养

第二部分重组人p53腺病毒基因药物（rAd/p53）诱导人鼻咽癌、喉癌细胞凋亡和抑制肿瘤生长的实验研究

重组人腺病毒制品（rAd/p53）抗肿瘤作用机制研究进展及其抑制喉癌、鼻咽癌细胞生长的实验研究进展

致谢