骨髓间充质干细胞诱导分化模型的建立及其在环境化学物骨质损伤机制研究中的应用

摘要

目的 1、建立和完善小鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)的体外培养体系，最大限度地获得BMSCs。2、建立BMSCs的体外诱导分化模型。3、探讨氟化钠和酒精对间充质干细胞的毒性作用的机制，从而为防治氟骨病和酒精引起的股骨头坏死、骨质疏松等损伤机制研究提供科学依据。 方法 1、无菌取C57／BL6小鼠骨髓，用全骨髓培养方法体外扩增BMSCs，免疫组织化学染色鉴定BMSCs的阳性表面标志物CD90和阴性表面标志物的CD34，绘制细胞的生长曲线。2、以含地塞米松、β-磷酸甘油钠和维生素C的a-MEM培养液诱导BMSCs向成骨细胞方向分化，分别于不同时间收获细胞进行成骨细胞的早、中、晚期指标鉴定。以含地塞米松和胰岛素的a-MEM培养液诱导BMSCs向脂肪细胞方向分化，油红O染色鉴定脂肪细胞。3、分别用含不同浓度的NaF、Et和Ach的基础培养液染毒细胞，3天后收获细胞行MTT试验、c-fos免疫组织化学染色检测毒物对细胞的毒性；分别用含NaF、Et或Ach的成骨诱导培养液染毒细胞，于3，8，15天后分别行ALP含量测定，VEGF、TAZ、OPG、Collagen type I、PPAR γmRNA的定量PCR实验，以及基质钙含量的测定。15天后行油红O染色计数脂肪细胞。 结果 1、该方法分离获得的BMSCs细胞活性好，增殖能力旺盛，在经历2天的生长潜伏期后细胞进入旺盛增殖期，且能在体外长期培养(3个月)，但是此时细胞增殖能力减弱，镜下可见许多衰老死亡细胞，形念较差，且可见许多类似成骨细胞和脂肪滴出现。表面标志物的免疫组织化学染色鉴定细胞CD90阳性，CD34阴性。2、成骨诱导分化实验结果显示于不同时间点检测成骨细胞的早、中、晚期指标ALP、ColI和基质钙沉积均显著增加，有统计学差异。脂肪细胞诱导分化实验结果显示BMSCs在脂肪诱导5～6天后，即可见有些细胞内出现小的脂滴，继而聚集成大的脂肪滴，细胞增殖能力减弱，细胞变圆，油红O染色呈阳性结果。3、MTT检测发现乙醇浓度在100mmol／L以上时表现出细胞增殖抑制现象；乙醛呈双相作用，即乙醛在2.0mmol/L以上时抑制细胞增殖，在0.036mmol／L以下时促进细胞增殖。c-fos蛋白免疫组织化学实验显示乙醇在25、100mmol／L时分别为降低和增加c-fos蛋白水平，50mmol／L时与对照组比较无统计学差异。乙醛在0.036mmol／L时抑制c-los蛋白水平，在0.18、0.90mmol／L时差异无统计学意义。乙醇、乙醛及成骨诱导因子对细胞的总蛋白水平均无显著影响。成骨诱导分化后细胞的VEGF、PPARγ 、TAZ等多种基因的mRNA水平和成骨细胞的功能指标均上调，乙醇能抑制BMSCs分化前后ALP、ColI和胞外基质钙沉积，促进成骨诱导分化前后脂肪细胞的分化，上调脂肪细胞分化的关键基因PPARγ的mRNA，下调调控BMSCs成脂与成骨分化的基因TAZ mRNA表达水平：降低血管生成因子VEGF和OPG mRNA。乙醛处理后BMSCs成骨分化前后的ALP、钙沉积量与相应对照组比较均无统计学差异，但是ColI mRNA的水平被大幅度的抑制，BMSCs分化前的VEGF无显著影响，PPAR γ基因上调，成骨分化时乙醛处理后细胞VEGF、TAZ和OPG的基因表达降低，脂肪细胞数量显著增加。4、NaF在10<'-3>mol／L以上抑制细胞增殖，低于此浓度促进细胞增殖。在低浓度10<'-5>mol／L时NaF抑制c-fos蛋白水平，在10<'-4>、5x10<'-4>mol／L时差异无统计学意义。NaF对细胞的总蛋白水平也无显著影响。成骨诱导分化后细胞的VEGF、PPAR γ、 TAZ等多种基因的mRNA水平和成骨细胞的功能指标均上调，NaF处理后BMSCs成骨分化前的ALP与相应对照组比较无统计学差异，但是成骨分化后的ALP与钙沉积量则显著降低。Col I、PPARγmRNA的水平在成骨分化前后均被NaF抑制，NaF处理后BMSCs成骨分化前的VEGF、TAZ无显著影响，脂肪细胞数量增加，成骨分化时细胞VEGF、TAZ的基因表达均降低，但是OPG基因表达无显著影响。 结论1、本实验采用的BMSCs体外分离培养方法成功建立，能获得大数量高纯度且具有多向分化潜能的细胞，可以满足毒理学实验所需。 2、将BMSCs应用于环境化学物质的骨质损伤机制研究中可观察到化学物早期的常规毒性和分化毒性，并可观察到化学物对细胞不同分化阶段的反应和潜在的远期效应，既节省实验周期又减少了体内试验的多种混杂因素，能很好地满足毒理学要求。2.1乙醇在10<'-3>3mol／L以上时可抑制BMSCs的增殖，从而降低了向成骨细胞分化的细胞数量，且此作用可能与c-fos蛋白有关。此外，乙醇不仅能抑制BMSCs的成骨分化潜能，促进它向脂肪细胞分化，而且能阻碍分化后成骨细胞的功能与成熟，并抑制细胞分泌血管生成因子和破坏BMSCs成骨与成脂分化以及骨生成与吸收之间的平衡。乙醛对BMSCs的细胞毒性较乙醇大，此作用可能也与c-fos蛋白有关。乙醛的成骨抑制毒性发生较晚，主要在成骨分化期，但是毒性强度较乙醇大。它能特异性地抑制BMSCs分化前后胶原酶的基因表达，阻碍细胞成骨分化时分泌血管生成因子和破坏成骨与成脂分化间的平衡，下调OPG表达间接增强骨吸收作用，促进脂肪细胞的分化。2.2不同浓度的氟对BMSCs的细胞增殖能力呈双相作用，但是对于成骨分化的作用则呈多样性。氟对骨骼影响的阶段主要在成骨分化期，它能特异性地抑制BMSCs的I型胶原酶合成，增加脂肪细胞数量，但并未影响脂肪细胞分化基因，氟能阻碍分化后成骨细胞的功能与成熟，下调成骨与成脂分化问的平衡调控基因。

目录

论文说明：英文缩写词简表

声明

前言

第一部分BMSCs体外培养体系的建立及完善

第二部分BMSCs诱导分化模型的建立

第三部分BMSCs在环境化学物骨质损伤机制研究中的应用

全文总结

参考文献

综述骨髓间充质干细胞的生物学特征及其应用

致谢