缺氧对骨髓间充质干细胞骨向分化调控的体外研究

摘要

以成骨细胞为中心的骨改建是正畸牙移动的生物学基础，骨对机械力的反应是通过什么机制进行的目前并没有完全明了。但有一点是肯定的，在正畸力作用下由于压力侧受压导致血供减少，形成了缺氧的微环境。有学者推测，氧分压的改变可能是骨改建中潜在的扳机点“trigger”。现已证实间充质干细胞(MSCs)是成骨细胞的日仃体细胞，体外经诱导可向成骨细胞分化。关于缺氧对骨髓间充质干细胞骨向分化的影响及调控机理目前尚不清楚。 本研究拟通过体外分离、纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞，建立骨髓间充质干细胞骨向诱导分化细胞模型，采用Jouan三气缺氧培养体系；运用荧光标记技术、酶比活力定量检测、实时荧光定量PCR及Westernblotting蛋白免疫印迹等先进技术方法，研究不同作用时间的缺氧对骨髓间充质干细胞骨向分化中体现成骨功能效应的碱性磷酸酶(ALP)比活性、碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(0C)基因及骨特异性转录调控因子(Cbfal)基因和蛋白表达的影响；并对其丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路中的ERK和P38通路的调控机制进行初步探索。从细胞和分子生物学水平上深入系统地探讨机械力介导的微环境缺氧对骨髓间充质干细胞骨向分化的调控，从而为进一步阐明正畸牙移动骨改建机理奠定实验基础。 结果显示： 1．通过密度梯度离心法成功分离培养了rMSCs，结合贴壁法获得了较高纯度的3～5代rMSCs，并经骨向诱导可成功培养出具有成骨细胞表型的rBMSCs。 2．缺氧对rBMSCs骨向诱导分化中ALPase、比活性ALPase及OC mRNA的表达在作用的前12h均有一过性的升高作用，但无统计学意义；随作用时间的延长，有较明显的抑制作用，其中mRNA表达在72h和96h抑制效应最强，具有时效性。 3．Cbfal／OSF2 mRNA的表达在缺氧48h后非常下降显著，几乎不表达，72h和96t1分别下调了90％和89％；而其蛋白水平虽不如基因改变明显，但仍呈下降趋势，在96h也下调了63％。 4．缺氧培养下5min ERKl／2 MAPK信号通路被迅速激活，磷酸化程度升至Omin对照组的231％； 15min时有所回落，但仍维持较高激活水平；随后在45min时迅速下降，与135min和6h时一样维持在一基线水平。而P38 NAPK信号通路蛋白磷酸化水平无明显变化，维持在一基线水平，各时间点之间没有统汁学差别。 结论及提示： 1．rMSCs骨向诱导可成功模拟整个成骨细胞分化过程，为后续研究提供细胞学模型。 2．2％缺氧通过下调成骨功能蛋白ALPase酶活性、ALPase及OC基因表达对大鼠骨髓间充质干细胞骨向诱导分化成骨效应有抑制作用。 3．2％缺氧对大鼠骨髓间充质干细胞骨向诱导分化中作为成骨细胞特异性转录因子的核心结合因子Cbfal基因和蛋白表达的均有显著抑制作用。 4．ERKl／2 MAPK信号通路参与了缺氧抑制rBMSCs骨向诱导分化的调控过程：而P38 MAPK信号通路没有被激活，可能不参与调控。 缺氧很有可能就是通过抑制成骨细胞特异性转录因子cbfal这一关键节点下调ALPase及OC等这些代表成骨细胞功能状态的酶和细胞外基质蛋白的表达对大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化起抑制调控作用；而细胞对外界缺氧的应激很有可能是通过激活了ERKl／2 MAPK信号通路的级联反应介导Cbf α 1活性和表达发挥调控作用，由于间充质干细胞向成骨细胞分化信号转导问题的网络性和复杂性，尚不能说明其唯一性和重要性，但至少肯定参与了此调控过程。 推测可能调控机制:缺氧应激→激活ERKl／2 MAPK信号通路至胞内→MAPK转入核内→下调成骨细胞特异性转录因子Cbfal→结合成骨细胞特异性顺式作用元件2 0SE2→抑制碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨涎蛋白及骨钙素等的表达→生物学效应——抑制间充质干细胞骨向分化；从而为进一步阐明正畸牙移动骨改建机理奠定实验基础。

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缩略词表

前言

实验一 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和骨向诱导分化的体外实验研究

实验二 缺氧对大鼠骨髓间充质干细胞骨向诱导分化成骨效应的影响

实验三 缺氧对大鼠骨髓间充质干细胞骨向诱导分化核心结合因子Cbfa1基因和蛋白表达的影响

实验四 缺氧在大鼠骨髓间充质干细胞骨向诱导分化中MAP kinases信号通道的初步研究

全文总结

参考文献

综述 骨髓间充质干细胞骨向分化及核心结合因子a1的调控

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