寻常型天疱疮抗原桥粒芯糖蛋白4片段的克隆和免疫识别初步研究

摘要

天疱疮(pemphigus)是自身抗体介导作用于表皮角质形成细胞桥粒芯糖蛋白的自身免疫性大疱性皮肤和粘膜疾病，寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris，PV)是其中最为常见的亚型。尽管已经公认桥粒芯糖蛋白-1(desmoglein 1，Dsgl)和桥粒芯糖蛋白-3(desmoglein 3，Dsg3)及其自身抗体与天疱疮发病相关，但其确切的发病机制仍不清楚。新近有研究发现了人体组织桥粒芯糖蛋A-4(desmoglein4，Dsg4)是PV自身抗体的靶抗原，为该病的研究提供了新的线索。 本项研究目的是扩增人皮肤组织Dsg4胞外域(extracellular domains，ECD)ECl、EC2、EC3和EC4的核酸序列，进一步探讨其在PV发病中的作用。 首先根据Genebank中人Dsg4的cDNA序列资料，设计Dsg4胞外域ECl、EC2、EC3和EC4 4个DNA片段的特异性引物，通过逆转录聚合酶链反应(reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)法，以提取的人正常皮肤组织总RNA为模板，扩增桥粒芯糖蛋白4胞外域ECl、EC2、EC3和EC4目的基因；应用基因重组技术将目的基因分别与原核表达质粒载体pET32a在T4DNA连接酶作用下相连接，转化大肠杆菌(Escherichia coli，E．coli)DH5α感受态细菌，用含氨苄青霉素的LB(Luria-bertani)培养基平板筛选转化菌，重组质粒DNA序列测定鉴定。结果显示RT-PCR扩增产物经凝胶电泳得到4条均约为350bp的条带；分别与载体pET32a相连接后获得4个重组质粒pET32a-Dsg4 EC1、pET32a-Dsg4 EC2、pET32a-Dsg4 EC3和pET32a-Dsg4 EC4，DNA序列测定结果说明其插入片段序列与在Genebank登录的Dsg4胞外域ECl、EC2、EC3和EC4核酸序列完全一致，4个Dsg4胞外域cDNA读码框架正确。 然后，用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测重组表达的his6-Dsg4 ECl、his6-Dsg4 EC2、his6-Dsg4 EC3和his6-Dsg4EC4蛋白片段分别与PV患者、正常对照组及疾病对照组(包括大疱性类天疱疮，皮肌炎和系统性红斑狼疮患者)血清的免疫识别反应。结果表明重组表达的4个蛋白片段不与正常对照组血清反应，而均与PV患者和大疱性类天疱疮(Bullous pemphigoid，BP)患者血清反应，以及部分蛋白片段与结缔组织病患者血清反应。提示ECl、EC2、EC3和EC4在PV和BP发病中可能有其作用；在结缔组织疾病患者中的部分免疫识别能力有待扩大患者样本量后进一步证实。 目的： 扩增人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4(desmoglein.4，Dsg4)胞外域ECl、EC2、EC3和EC4的核酸序列。 方法： 通过逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)从人正常皮肤组织中抽提总RNA，逆转录合成eDNA，聚合酶链反应(PCR)扩增Dsg4胞外域ECl、EC2、EC3和EC4目的基因；应用基因重组技术将目的基因分别与质粒pET32a在T4DNA连接酶作用下相连接，转化大肠杆菌DH5cx(Ecoli DH5a)感受态细菌，用含氨苄青霉素的LB培养基平板筛选转化菌，阳性重组子DNA序列测定鉴定。 结果： RT-PCR扩增产物经凝胶电泳得到4条均约为350bp的条带；质粒载体pET32a连接的目的基因经序列测定后与在Genbank登录的Dsg4胞外域Eel、EC2、EC3和EC4核酸序列完全一致，4个Dsg4胞外域cDNA读码框架正确。 结论： 成功克隆得到的Dsg4胞外域ECl、EC2、EC3和EC4多肽片断为进一步探讨天疱疮的发病机制打下了基础。 目的： 探讨寻常型天疱疮(PV)抗原Dsg4片段的抗原性，为其发病机制的研究提供依据。 方法： 用ELISA法检测重组表达his6-Dsg4 ECl、his6-Dsg4 EC2、his6-Dsg4EC3和his6-Dsg4 EC4蛋白片段分别与PV患者、正常对照组及疾病对照组血清的免疫识别反应，检测结果进行抗原性分析。 结果重组表达his6-Dsg4 EC1、his6-Dsg4 EC2、his6-Dsg4 EC3和his6-Dsg4 EC4蛋白片段与正常对照组血清不发生免疫识别反应，而均与PV患者和大疱性类天疱疮(BP)患者血清发生免疫识别反应，以及部分蛋白片段与结缔组织病患者血清发生免疫识别反应。 结论： ECl、EC2、EC3和EC4可能在PV和BP发病中起作用，在结缔组织疾病患者中的都分免疫识别能力有待扩大患者样本量后证实。

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本文主要缩略语

前言

第一部分人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4（Dsg4）胞外域基因片段的克隆 摘要

第一部分人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4（Dsg4）胞外域基因片段的克隆 英文摘要

第一部分人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4（Dsg4）胞外域基因片段的克隆 引言

第一部分人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4（Dsg4）胞外域基因片段的克隆 材料

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第一部分人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4（Dsg4）胞外域基因片段的克隆 结果

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第一部分人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4（Dsg4）胞外域基因片段的克隆 小结

第二部分寻常型天疱疮抗原桥粒芯糖蛋白4（Dsg4）片段免疫识别的初步研究 摘要

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