淋球菌外膜蛋白NspA和耐辐射奇球菌SOD基因的克隆和在乳酸菌中表达的初步研究

摘要

运用乳酸菌胞内表达载体pMG36e和分泌表达载体pVE5523，构建淋病奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface protein A，NspA)和耐辐射奇球菌锰超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase，Mn-SOD)两种目的基因的表达重组子，将重组子经电穿孔转化乳酸乳球菌，初步研究乳酸乳球菌表达融合NspA和SOD的情况，为筛选目的基因的乳酸菌表达载体提供依据和思路；为后续开发淋球菌外膜蛋白的乳酸菌双功能活菌疫苗提供参考；为进一步研究SOD的表达对乳酸菌生物学特性的影响、开发可直接食用型SODU产品或微生态制剂奠定基础。 方法 本研究内容分两部分： 1．pMG36e-nspA和pMG36e-sod重组子的构建和在乳酸菌中表达 1)优化CTAB法提取淋球菌和耐辐射奇球菌基因组的条件；设计引物，优化PCR 扩增目的基因nspA和sod的条件；目的基因分别与乳酸菌胞内表达载体pMG36e连接，构建表达重组子pMG36e-nspA和pMG36e-sod，将表达重组子转化E coli DH5a，利用红霉素抗性筛选阳性克隆，质粒小量提取后，双酶切和测序鉴定。 2)优化乳酸乳球菌MGl363感受态细胞制作和重组质粒电穿孔转化该细胞的条件；将鉴定正确的表达重组子分别经电穿孔转化MGl363感受态细胞，通过SDS．PAGE、Western blot、SOD活性测定等方法，初步研究重组菌MGl363-pMG36e-nspA和MGl363-pMG36e-sod表达融合NspA和融合SOD的情况。 2．pVE5523-nspA和pVE5523-sod重组子的构建和在乳酸菌中表达的初步研究 1)设计引物，PCR扩增目的基因nspA和sod，然后分别与乳酸菌分泌表达载体pVE5523连接，构建表达重组子pVE5523-nspA和pVE5523-sod，将表达重组子转化E coli JMl09，利用红霉素和氨卞青霉素两种抗性筛选阳性克隆，质粒小量提取后，双酶切鉴定。 2)将鉴定正确的表达重组子分别经电穿孔转化MGl363感受态细胞，初步分析重组菌MGl363-pVE5523-nspA和MGl363-pVE5523-sod分泌表达融合NspA和融合SOD的情况。 结果 1．得到优化的以下条件：CTAB法提取淋球菌和耐辐射奇球菌基因组、PCR扩增目的基因、乳酸乳球菌MGl363感受态细胞的制作以及重组子电穿孔转化该细胞的条件。 2．成功构建了两套目的基因nspA和sod的乳酸菌表达重组子pMG36e-nspA、pMG36e-sod和pVE5523-nspA、pVE5523-sod。 3．将鉴定正确的pMG36e-nspA和pMG36e-sod表达重组子经电穿孔高效率转化MGl363感受态细胞，重组菌MGl363．pMG36e-sod胞内SOD的比活性是272.36U／mg pro，载体对照菌MGl363-pMG36e胞内SOD的比活性是52.42 U／mg pro，表明融合SOD胞内表达成功，但表达量还不高。SDS-PAGE、Westem b10t分析结果未能检测到NspA融合蛋白的表达条带，提示该载体可能不适宜表达该膜蛋白，迫切需要寻求新的乳酸菌表达载体。 4．将鉴定正确的pVE5523-nspA和pVE5523-sod表达重组子经电穿孔高效率转化MGl363感受态细胞。重组菌MGl363-pVE5523-sod上清液中SOD的比活性是2135.6 U／mg pro，载体对照菌MGl363-pVE5523上清液中SOD的比活性是266.1 U／mg pro，表明融合SOD分泌表达成功且具有较高活性。但沉淀上清液中蛋白质的条件以及Western blot检测MGl363-pVE5523-nspA上清液中融合NspA表达情况的条件还有待进一步优化。 结论 本研究选取淋球菌外膜蛋白NspA和耐辐射奇球菌SOD为目的基因，成功将它们克隆于乳酸菌表达载体pMG36e和pVE5523，初步研究乳酸乳球菌表达这两种目的基因的情况。结果显示，具有酶活性的融合SOD被成功表达，pVE5523载体系统的表达量相对pMG36e载体系统的表达量较高，后续将研究融合SOD的表达对乳酸菌生物学特性的影响；pVE5523可能比pMG36e更适合表达膜蛋白NspA，但pVE5523分泌表达NspA的情况有待进一步研究。

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摘要

前言

课题总技术路线

第一部分：pMG36e-nspA和pMG36e-sod重组子的构建和在乳酸菌中表达 引言

第一部分：pMG36e-nspA和pMG36e-sod重组子的构建和在乳酸菌中表达 1材料与方法

第一部分：pMG36e-nspA和pMG36e-sod重组子的构建和在乳酸菌中表达 2结 果

第一部分：pMG36e-nspA和pMG36e-sod重组子的构建和在乳酸菌中表达 3讨 论

第二部分：pVE5523-nspA和pVE5523-sod重组子的构建和在乳酸菌中表达的初步研究 引言

第二部分：pVE5523-nspA和pVE5523-sod重组子的构建和在乳酸菌中表达的初步研究 1材料与方法

第二部分：pVE5523-nspA和pVE5523-sod重组子的构建和在乳酸菌中表达的初步研究 2结 果

第二部分：pVE5523-nspA和pVE5523-sod重组子的构建和在乳酸菌中表达的初步研究 3讨 论

全文总结

参考文献

综述粘膜免疫抗原递送活载体的研究进展

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