pSUPER载体介导的siRNA抑制肝癌多药耐药基因mrp1的表达

摘要

目的:①构建pSUPER-shRNA/mrp1的表达载体，为探讨体内、体外抑制肝细胞癌(Hepatocelluar carcinoma，HCC)多药耐药基因(Multidrug resitance，MDR)表达的方法提供实验基础。②观察pSUPER-shRNA/mrp1对HepG2/mrp1细胞生长的影响作用，研究mrp1基因的功能。③探讨pSUPER-shRNA/mrp1对HepG2/mrp1细胞MDR抑制作用及其作用的机理。④观察pSUPER-shRNA/mrp1对活体HepG2/mrp1细胞移植瘤的抑制作用及初步探讨其毒副作用。 方法:从GenBank查mrp1基因序列，L05628，利用InvivoGen公司提供的计算机设计软件，根据siRNA的设计原则，寻找合适的siRNA靶序列，采用BLAST软件，对选择的靶序列进行同源分析，排除非特异性地抑制其他基因片段的可能，从mrp1基因中选择5段各21个碱基的特异性靶序列，分别设计5组寡核苷酸链，第5组是对照组。每条寡核苷酸包括：两端用于形成酶切位点的序列，两个反向互补排列的21nt mrp1特异性序列，中央被一个9nt的间区隔开，用于形成茎环结果，每条链64nt退火后形成两端各带Bgl Ⅱ、HindⅢ位点的dsRNA。将5组dsRNA分别重组到pSUPER载体构建P1、P2、P3、P4、P5表达载体，PCR初步筛选重组子，质粒测序确定碱基序列正确的重组载体。构建成功后的表达载体转染HepG2、HepG2/mrp1细胞株和皮下接种于裸鼠的移植瘤。进行一系列的细胞和动物实验：①观察转染pSUPER-shRNA/mrp1对HepG2/mrp1细胞生长的作用；②用RT-PCR、Western blot杂交测定细胞mrp1基因转录后其mRNA的水平和MRPl蛋白表达水平；③流式细胞术分别检测MRP1蛋白的表达水平和细胞内柔红霉素(DNR)积累量；④MTT法检测转染后细胞的耐药性；⑤裸鼠成瘤实验，观察HepG2、HepG2/mrp1细胞成瘤情况；⑥肿瘤治疗实验，瘤内注射pSUPER-shRNA/mrpl、pSUPER-shRNA/mrplnegative vectors，质粒载体0.75mg/kg，和腹腔内注射ADM1.5mg/kg，观察裸鼠及肿瘤生长及肿瘤抑制率情况；⑦药物毒副作用试验，检测并比较转染前后裸鼠肝肾功能及白细胞变化，并做心、肝、肾、肺组织解剖病理学检查。 结果:①成功合成重组质粒pSUPER-shRNk/mrp1载体P1、P2、P3、P4、P5并可以有效地进行体外、动物体内转染，说明pSUPER-shRNA/mrpl能直接细胞内合成、表达siRNA，有好的稳定性，以P4效果最好；②转染pSUPER-shRNA/mrpl的HepG2/mrp1细胞，P4组mrp1 mRNA转录水平下调(88.03±2.04)％，多药耐药相关蛋白MRP1的表达量下降至(10.2±1.3)％，相对逆转效率89.2％，细胞内DNR积累量明显增加；③成功建立裸鼠肝癌种植瘤模型，成瘤率均为100％；④裸鼠肝癌种植瘤经转染pSUPER-shRNA/mrp1，ADM化疗前后实验组肿瘤体积差613.24±28.58mm<'3>，肿瘤生长率(10.35±1.26)％，与对照组比较差异均有统计学意义[1120.04±90.76&(17.90±4.58)％，P<0.05]，肿瘤抑制率达45.0％；⑤D、E、F三组裸鼠均行肝肾功能及血液常规检测，及心、肝、肾、肺病理学检查。结果显示，组间均无明显差异，显示pSUPER-shRNA/mrpl体内转染抑制HepG2/mrp1特定基因mrpl的表达，无明显的毒副作用，用于逆转肿瘤细胞的多药耐药具有良好的安全性。 结论:①在HCC细胞中mrpl基因是介导多药耐药的基因，在HCC耐药过程中具有重要作用。②pSUPER载体介导的siRNA/mrp1能下调mrp1 mRNA的水平，抑制MRP1的表达。③经瘤内注射可显著逆转肝细胞癌的耐药性，且初步探讨其毒副作用较小，具有很好的安全性。④为RNA干扰技术逆转肝细胞癌多药耐药应用于临床提供了较为可靠的理论依据。

目录

论文说明：缩略词中英文对照

声明

前言

第一部分mrp1靶向性siRNA表达载体pSUPER/siRNA的构建及其逆转肝癌细胞多药耐药的体外实验研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分siRNA/mrp1逆转肝癌细胞多药耐药的体内实验及其毒副反应研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

全文总结

问题与不足

文献综述 siRNA干扰技术和应用

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致谢