载ATM反义寡核苷酸纳米粒对小鼠头颈鳞癌放射增敏基因治疗的实验研究

摘要

目的：(1)探讨PLGA材料制备的纳米粒(nanoparticle，NP)载体导入ATM反义寡核苷酸在小鼠头颈鳞癌基因治疗中的可行性，期望为头颈肿瘤基因治疗中载体的选择提供一个新的研究思路；(2)通过体内及体外实验探讨阻断ATM基因表达对小鼠头颈鳞癌放射增敏作用的机理，期望为头颈鳞癌的特异性放射增敏基因治疗的研究开辟一条新途径。 方法：(1)以PLGA为材料，采用W/O/W双乳化溶剂蒸发法制备载ATM反义寡核苷酸NP(ATM-ASODN-NP)、载ATM正义寡核苷酸NP(ATM-SODN-NP)及空白NP，检测其理化性质，确定稳定的制备工艺流程；(2)载ATM寡核苷酸纳米粒转染SCCⅦ细胞株，应用荧光显微镜和流式细胞仪观察分析NP转染细胞的情况；通过实时荧光定量PCR检测体外转染后ATM基因mRNA表达水平，以Western Blot方法检测转染后ATM蛋白表达水平；(3)转染细胞后，联合直线加速器放射治疗，应用细胞克隆试验和MTT试验了解细胞的放射敏感性，通过流式细胞仪检测不同干预组细胞周期分布和凋亡情况；(4)C3H/He小鼠口底接种SCCⅦ细胞，构建小鼠头颈鳞癌移植瘤模型；(5)肿瘤内注射载ATM寡核苷酸纳米粒进行干预，通过HE染色观察移植瘤组织病理特性，免疫组化分析ATM蛋白表达水平；(6)移植瘤内基因干预与放射治疗相结合，通过观察肿瘤生长抑制情况以及Tunel染色法分析肿瘤细胞凋亡情况，了解SCCⅦ移植瘤放射敏感性的改变。 结果：(1)获得了制备载寡核苷酸纳米粒工艺流程，PLGA纳米粒平均粒径为116±25.2nm，PDI小于0.15，载寡核苷酸纳米粒包封率为47.45％，与裸寡核苷酸相比具有抗核酸酶能力；(2)ATM-ASODN-NP体外转染SCCⅦ细胞抑制ATM基因mRNA和ATM蛋白表达效率较对照组增高(p<0.05)；(3)细胞克隆试验显示ATM-ASODN-NP转染SCCⅦ细胞与放疗联合降低了肿瘤细胞克隆形成能力，MTT试验显示细胞生长被抑制(p<0.05)；(4)流式细胞学技术检测结果发现ATM-ASODN-NP转染SCCⅦ细胞与放疗联合，G2/M期阻滞受抑制，细胞凋亡率增加(p<0.05)；(5)C3H/He小鼠口底构建的SCCⅦ细胞移植瘤具有头颈肿瘤的生物学特性，免疫组化分析显示瘤内注射ATM-ASODN-NP组ATM蛋白表达降低(p<0.05)；(6)肿瘤内基因干预与放射治疗相结合，ATM-ASODN-NP组肿瘤生长抑制率增加，Tunel染色法显示ATM-ASODN-NP组肿瘤细胞凋亡率增高(p<0.05)。 结论：(1)载寡核苷酸纳米粒制备工艺流程稳定可靠，作为基因治疗细胞转染载体具有可行性；(2)转染ATM-ASODN-NP的SCCⅦ细胞ATM基因mRNA及ATM蛋白表达下调，与放射治疗联合抑制了SCCⅦ细胞生长，促进细胞凋亡，提高了放射敏感性；(3)构建的C3H/He小鼠口底SCCⅦ细胞移植瘤具备头颈肿瘤组织病理和生物学特性，瘤内注射ATM-ASODN-NP降低了ATM蛋白的表达，与放射治疗联合抑制了肿瘤的生长，细胞凋亡率升高，放射敏感性增加。

目录

论文说明：缩略词表

声明

前 言

第一部分：载ATM寡核苷酸纳米粒的制备

引 言

材料和方法

结 果

讨论

小 结

参考文献

第二部分：载ATM反义寡核苷酸纳米粒对小鼠头颈鳞癌细胞放射增敏的体外实验研究

引 言

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第三部分：载ATM反义寡核苷酸纳米粒对小鼠头颈鳞癌放射增敏的体内实验研究

引 言

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

综述一：纳米载体在肿瘤基因治疗中的应用进展

综述二：头颈肿瘤放射敏感性和放射增敏研究进展

研究生期间发表文章

致 谢