耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药机制与金属酶、整合子的关系研究

摘要

铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)广泛存在于自然界，也是临床上重要的条件致病菌，在引起院内感染的病原菌分离率中位居前列，且经常检出多重耐药株。亚胺培南是迄今为止开发的抗菌药物中抗菌谱最广、抗菌作用最强的一类碳青霉烯类抗生素，大多数革兰阴性杆菌都对其敏感，随着碳青霉烯类药物使用的越来越广泛，细菌对其耐药的情况也逐年增多，耐亚胺培南的耐药株往往导致在临床上无药可治的地步。产金属酶(Metallo-β-Lactamases， MBL)是细菌耐碳青霉烯类抗生素主要机制之一，MBL基因可以位于整合子上，通过质粒、转座子的移动在同种和不同种类的细菌间传播。MBL中临床最常见的是IMP-1和1VIM-2亚型，整合子中临床最常见的是第一类整合子。本研究的目的是探讨耐亚胺培南PA临床分离株中MBL，的携带情况及在耐药中的作用，研究第一类整合子在产MBL铜绿假单胞菌中的分布以及基因盒的携带情况，为细菌耐药传播的研究学提供流行病学基础资料。 本研究收集了72株临床分离的PA，分离科室最多的前三位是： ICU病房、呼吸科和外科，对AMK的耐药率最低，为31.9％。其中61株对亚胺培南耐药，耐药率为84.7％。采用琼脂平板对倍稀释法对其中的耐亚胺培南的42株PA做药敏实验。发现耐药率由低到高的分别为：AMK(31.O％)、CAZ(38.1％)、CIP(47.6％)、PIP(64.3％)。接着将这42株菌做平板CAZ-MPE纸片协同实验，CAZ和MPE纸片圆心距离为1.O～2.5cm，两个CAZ纸片间圆心距离为4.5cm。观查两者抑菌圈靠近处有无直径扩大的协同现象：阳性结果的有27株，共7种表型，为首次对协同现象的结果进行细致分型。对所有菌株进行MBL基因IMP-1和VIM的PCR检测，VIM的阳性株进一步进行VIM-1以及VIM-2基因的PCR检测。72株PA中发现55株携带有VIM型MBL基因，携带率为76％，进一步的亚型检测中未发现VIM-1型基因，只发现一株携带VIM-2基因。这55株查出携带VIM基因的PA中有53株PA对亚胺培南耐药，2株对亚胺培南敏感，可见含有.MBL基因未必就表达为耐药。11株对亚胺培南耐药的PA未查见含有MBL基因，推断是因为耐亚胺培南还可以通过其它耐药机制来表达，比如OprD蛋白的缺失、外排泵的高度表达等。这55株之外的一株检出携带IMP-1型MBL基因。对于耐亚胺培南的61株PA，MBL基因携带率则为87％。纸片协同实验阳性结果的27株中，一株检出携带IMP-1型基因，一株检出携带VIM-2型基因，其余的25株的VIM基因PCR检测都是阳性结果。 本研究为首次在中国西南地区发现IMP-1型MBL基因。PA9917的IMP-L 基因PCR检测为阳性，PCR产物测序得906个碱基，在GenBank上比对与产IMP-1酶PA的编码基因(注册号：AY251052.1)同源性为100％，即可确认为工MP-1金属酶基因。经PCR检测和测序比对，确认含有第一类整合酶基因(与DQ219465.1的含有第一类整合子PA同源性为100％)以及约1800bp大小的第一类整合子基因盒。但是第一类整合子的基因盒测序结果未见MBL基因；GenBank上比对与多种细菌包括：肺炎克雷伯菌、枸橼酸杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、沙门菌亚属菌均为100&同源，包含有aadA2基因，它编码二氢叶酸还原酶，链霉素/大观霉素3’磷酸腺苷转移酶。说明不同菌属的菌株可含有完全相同的整合子基因盒。与PA(注册号：ABl91047.1)同源性为99％，它也含有二氢叶酸还原酶，链霉素/大观霉素 3’磷酸腺苷转移酶的基因，在ABl91047.1的859位为 G，对应氨基酸为L(亮氨酸)；而本实验所测为A，对应氨基酸为F(苯丙氨酸)。由于所在的开放读码框编码的是未知功能的蛋白，所以此突变是否有意义仍未知，有待进一步研究。PA 9917提取质粒实验为阳性结果，但是进行质粒的IMP-1 基因PCR检查结果为阴性，推断可能是因为IMP-1基因位于染色体上。本研究也是首次在中国西南地区发现VIM型MBL基因。PA 895携带VIM基因，经VIM-2基因PCR检测为阳性结果，产物纯化后测序网上比对，与注册号DQ522236.1的铜绿假单胞菌同源性为100％，确认PA 895产VIM-2型MBL。但是第一类整合子PCR检测、质粒提取实验均为阴性结果。质粒提取为阴性结果，可能是VIM-2基因所在的质粒太大没有提取出来，也可能是本次检测出的VIM-2基因不在质粒上，在染色体上。 PA 9917和PA 895都对亚胺培南耐药；CAZ和2-MPE的纸片协同实验结果都是阳性；琼脂平板对倍稀释药敏实验都是除了对环丙沙星敏感外，其余都耐药的高耐菌株。PA 9917对亚胺培南的MIC为32μg/mL，PA 895则高达512μg/mL，而亚胺培南耐药的标准是MIC大于8μg/mL；对于头孢他啶的MIC分别为64u g/mL和128μg/mL，皆为高度耐药。 本研究为首次对耐亚胺培南且产MBL的PA中第一类整合子及基因盒的携带情况作一调查。56株MBL基因PCR阳性PA中，26株携带有第一类整合酶基因，所以第一类整合子的检出率为46.4％。在这26株中又只有18株含有第一类整合子基因盒，第一类整合子阳性株中基因盒的携带率为69.2％(18株/26株)，基因盒扩增产物可根据电泳图谱分为5种型别。55株为VIM阳性株，其中25株检出含有第一类整合子，这25株PA中又只有17株含有第一类整合子基因盒；1株产IMP-1的PA含有第一类整合酶基因与第一类整合子基因盒。它的IntIl整合酶基因PCR产物纯化测序得906个核苷酸，在GenBarlk上进行比对，与含有第一类整合子的PA基因(注册号：DQ219465.1)同源性为100％。接着进行第一类整合子基因盒扩增产物的测序，得1836个核苷酸，比对与肺炎克雷伯菌(注册号：AY7484-53.1)100％同源，包含有aadA2基因，它编码二氢叶酸还原酶，链霉素／大观霉素3’磷酸腺苷转移酶。但是GenBank上比对与PA(注册号： ABl91047.1)同源性为99％，在ABl91047.1的859位为G，对应氨基酸为L(亮氨酸)；而本实验所测为A，对应氨基酸为F(苯丙氨酸)。由于所在的开放读码框编码的是未知功能的蛋白，所以此突变是否有意义仍未知，有待进一步研究。 发现一种突变的第一类整合子基因盒：耐亚胺培南且纸片协同实验阴性的PA 9576的第一类整合酶PCR检测为阳性结果，接着进行第一类整合子基因盒的检测发现：与第一类整合子基因(注册号为 ABl89979.1，PA)同源性为98％，含有二氢叶酸还原酶、aadA5基因，突变碱基对应的基因功能为编码二氢叶酸还原酶。6个氨基酸突变位点如下：101(D-N)、117(T-S)、118(V-G)、120(V-D)、121(E-K)、122(V-L)，突变的意义未知，有可能影响叶酸代谢从而影响细菌核酸和蛋白质的合成；又因为磺胺类药物的作用机制就是作为二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂，所以推断突变与磺胺耐药有关，而细菌对磺胺的耐药性一旦产生就往往是永久性、不可逆的。 本实验结果高度提示产PA产MBL和对IMP耐药关系密切，协同实验阳性结果高度提示菌株产金属酶，产MBL的PA中几乎一半含有第一类整合子，基因盒携带率为69.2％，含有整合子与产MBL的PA对于IMP耐药机制关系密切，对耐药的传播起到重要作用。本研究对进一步研究铜绿假单胞菌耐亚胺培南的机制，整合子在金属酶基因耐药传播中的作用提供依据，为控制细菌耐药性形成、开发新的抗生素进行临床治疗提供思路。

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摘要

综述 金属β-内酰胺酶的研究进展

第一部分临床分离铜绿假单胞菌的分离鉴定和耐药性分析

第二部分耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药机制与金属酶关系的研究

第三部分耐亚胺培南铜绿假单胞菌产金属酶与第一类整合子关系的研究

结论

参考文献

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致谢