Me基因诱导的特异性抗流感病毒免疫应答及保护作用

摘要

目的: 甲型流感病毒是广泛传播的呼吸道病原体，它曾经在上世纪导致三次世界性的流感大流行，疫苗接种是预防流感病毒感染最有效的措施。目前的流感病毒疫苗主要是针对诱导中和抗体的表面糖蛋白一血凝素(hemmagglutinin，HA)，但由于HA容易发生抗原漂移和抗原转变，使得流感病毒很容易逃脱免疫监视，因此每年都必须根据WHO的建议更新疫苗株以预防流感病毒感染人类。到目前为止，还没有商品化的具有广谱交叉保护性的人流感病毒疫苗被研究开发出来。 已有的研究资料表明，流感病毒M2蛋白胞外功能区M<,2>e(theextracellular domain of influenza virus M<,2> protein，M<,2>e)具有相当的保守性。在Genbamk中，716株不同宿主和不同型别的甲型流感病毒株，其M2e都具有相似的氨基酸序列，其中N端的9个氨基酸几乎完全相同，第10-20位氨基酸虽具有相对较高的变异率，但这个高变序列中也存在一些不变的残基。M<,2>e氨基酸序列的第6-13位为EVETPIRN表位，该表位能够诱导M<,2>e特异的保护性抗体产生，具有显著的免疫原性。因此，M<,2>e蛋白被认为是待开发的、可刺激机体产生对不同流感变异株都具有交叉保护效果的、并极具潜力的保护性抗原。本研究从构建表达流感病毒M2e的真核表达载体pcDNA3.1(+)-M<,2>e开始，并将其作为核酸疫苗研究其诱导的特异性抗流感病毒免疫应答和免疫保护作用。以便为今后进一步研究、开发和应用具有交叉保护能力的广谱流感疫苗奠定了基础。 方法: (1)根据Genbank(NCBI ISDNl3425)中查得的M<,2>e编码序列，设计并合成两条长84nt的DNA单链。将合成的两条寡核苷酸链退火使之互补结合成为M<,2>e编码序列。然后将退火后的双链DNA插入到经双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-M<,2>e，并经酶切和DNA测序鉴定。 (2)将鉴定正确的真核表达载体pcDNA3.1(+)-M<,2>e转染HEK293细胞，用G418筛选到稳定转染的细胞株。对筛选得到的细胞株采用细胞免疫荧光染色方法鉴定M<,2>e蛋白的表达情况；同时收集转染细胞的培养上清做淋巴细胞增殖实验(MTT法)，以鉴定表达的M<,2>e蛋白是否分泌到细胞外。 (3)用酚-氯仿法大量抽提pcDNA3.1(+)-M<,2>e质粒，酶切鉴定扩增的质粒。将实验小鼠随机分为pcDNA3.1(+)-M<,2>e组、空载体pcDNA3.1(+)组和无处理对照组，以1001xg pcDNA3.1(+)-M<,2>e或pcDNA3.1(+)真核表达质粒分别经小鼠大腿肌肉注射，共免疫三次，每次间隔两周。分别在初次免疫和加强免疫一周后检测抗-M<,2>e抗体和细胞免疫的产生情况。抗-M<,2>e抗体检测采用ELISA法，即用从裂解的流感病毒包膜蛋白中分离纯化的M<,2>抗原包板，与小鼠血清中的抗-M<,2>e抗体反应，然后经酶标记抗体和底物显色。细胞免疫检测则分别摘取各处理组小鼠的脾脏，分别以RMPT1640、转染细胞的培养上清、纯化病毒消化裂解后收获的抗原、5mg/L的ConA为刺激物，做淋巴细胞增殖实验。末次免疫后间隔一周，以10×LD<,50>流感病毒攻击BALB/c小鼠，观察攻击后的小鼠存活情况，并取小鼠肺组织做病理切片，以评价pcDNA3.1(+)-M<,2>e的免疫保护作用。 结果: (1)在PcR仪中通过程序性退火，得到互补结合的DNA双链，通过2.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，其大小与预期值相符。所构建的pcDNA3.1(+)-M<,2>e真核表达质粒经Hind Ⅲ和 EcoR Ⅰ双酶切，琼脂糖电泳显现酶切小片段大小约80bp。真核表达质粒pcDNA3.1(+)-M<,2>e采用ABl3730测序仪测序鉴定，结果显示构建的质粒不仅没有碱基突变，而且其读码框架也没有变化。 (2)真核表达质粒pcDNA3.1(+)-M<,2>e转染HEK293细胞后，在400μg/ml的G418作用下，经10d筛选得到了pcDNA3.1(+)-M<,2>e稳定转染的细胞株。免疫荧光实验结果显示，转染质粒pcDNA3.1(+)-M<,2>e的HEK293细胞膜上有荧光，而对照细胞没有荧光。加入转染了pcDNA3.1(+)-M<,2>e的细胞培养上清后，淋巴细胞增殖明显比对照组增多，而且随着培养上清稀释度的降低，其刺激作用明显下降，差异有显著性(P<0.05)。 (3)酚.氯仿法抽提得到扩增的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-M<,2>e，经Hind Ⅲ和 EcoR Ⅰ双酶切，琼脂糖电泳显现酶切小片段大小约80bp。ELISA法检测小鼠血清中抗.M<,2>e抗体的结果显示，加强免疫后pcDNA3.1(+)-M<,2>e组血清中抗体水平显著升高，且二次加强免疫后抗体水平更高，而空载体pcDNA3.1(+)组和对照组均不能诱生相应抗体，差异有显著性(P<0.05)。淋巴细胞增殖实验结果显示，pcDNA3.1(+)-M<,2>e组的淋巴细胞对纯化的流感病毒抗原能够产生较强的增殖水平，其刺激指数为2.35。而空载体组和无处理对照组的淋巴细胞对纯化病毒消化裂解后收获的抗原则无明显的增殖反应，其刺激指数仅为1.03。小鼠在末次免疫一周后用10×LD<,50>的流感病毒(A/PR/8/34)经鼻腔进行攻击，空载体组和对照组小鼠在，7天内都死亡，而pcDNA3.1(+).M<,2>e实验组有3只小鼠可以存活，7天以上，其死亡保护率和平均生存天数均高于对照组，差异有显著性(P<0.05)。 结论： (1)成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-M<,2>e，并转染了HEK293细胞，在400μg/ml的G418作用下筛选得到了pcDNA3.1(+)-M<,2>e质粒稳定转染的HEK293细胞株，为深入评价pcDNA3.1(+)-M<,2>e核酸疫苗的免疫功能打下了基础。 (2)真核质粒pcDNA3.1(+)-M<,2>e稳定转染的HEK293细胞能够表达流感病毒M<,2>e蛋白，表达的蛋白不仅存在于细胞膜上，而且还可以分泌到培养上清中。 (3)真核表达质粒pcDNA3.1(+)-M<,2>e免疫小鼠后，不仅可以诱导特异性的体液免疫应答，也可以诱导特异性的细胞免疫应答，能够有效地保护小鼠抵抗流感病毒的致死性攻击。pcDNA3.1(+)-M<,2>e的核酸疫苗研究对预防流感具有潜在的应用价值，并为以后进一步利用M<,2>e开发具有交叉保护能力的广谱流感疫苗奠定了基础。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一部分甲型流感病毒M2e真核表达质粒的构建

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

第二部分pcDNA3.1（+）-M2e在真核细胞中的表达和分析

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

4.结论

第三部分pcDNA3.1（+）-M2e免疫小鼠及免疫效果的检测和分析

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

全文总结

参考文献

文献综述 甲型流感病毒基质蛋白M2的研究进展

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