慢病毒介导的RNA干扰逆转单因素耐药细胞系K562/MDR1耐药性的研究

摘要

研究背景: 耐药是化疗失败的一个主要原因。耐药产生的原因是多因素的，其中MDR1基因编码的P-gp蛋白最具代表性。在逆转MDR1基因的体外研究中通常采用的是药物诱导产生的耐药细胞系，其耐药为多种因素所致，且耐药性的维持不够稳定。 逆转MDR1基因及其产物所致耐药的途径有多种，但从理论上讲，在基因水平逆转MDR1基因才是解决问题的关键。而近来发展起来的RNA干扰技术，为MDR1基因的逆转提供了一种新的高效特异的方法。 慢病毒载体是一种很有前途的基因转移载体，可感染非分裂细胞，目的基因整合至靶细胞基因组而长期表达。通过慢病毒载体介导的RNA干扰，使长效抑制目的基因表达成为可能。 研究目的: 1．构建MDR1基因单因素所致耐药细胞模型K562/MDR1。 2．构建编码靶向MDRl基因shRNA的慢病毒载体。 3．研究慢病毒介导的RNA干扰对MDR1基因所致耐药性的逆转情况。 研究方法: 1．构建MDR1基因单因素耐药细胞系K562/MDR1：包装具MDR1基因全长cDNA的逆转录病毒，感染对化疗药物敏感的白血病细胞系K562，用秋水仙碱筛选耐药细胞，经无限稀释法克隆，得到单克隆的单因素耐药细胞系K562/MDR1。荧光定量PCR检测K562/MDR1的MDR1基因，流式细胞仪检测其P-gp蛋白表达，柔红霉素泵出实验检测P-gp蛋白功能，MTT试验检测其对化疗药物的敏感性。 2．慢病毒介导的RNA干扰逆转MDR1基因所致耐药性：构建编码靶向MDR1基因shRNA的慢病毒载体并测序，包装慢病毒，感染耐药细胞系K562/MDRl和K562/A02，从以下四方面研究RNA干扰后其耐药性的变化：荧光定量PCR检测MDRl基因在mRNA水平的变化，流式细胞仪检测P-gp蛋白表达水平的变化，柔红霉素泵出实验检测细胞药物外排能力的变化，MTT试验检测细胞耐药性的变化。 研究结果: 1．成功构建MDR1基因单因素耐药细胞系K562/MDR1：荧光定量PCR示MDR1基因相对定量值为2.79x10<'3>，远高于K562细胞；流式细胞仪检测细胞表面P-gp蛋白表达高达96.10％；柔红霉素泵出率为90.93％，显示了强大的药物外排能力；MTT结果示细胞明显对化疗药物耐药。 2．成功构建编码靶向MDR1基因shRNA的慢病毒载体：合成编码shRNA的DNA序列亚克隆到慢病毒载体plentilox 3.7，测序结果示插入正确。 3．慢病毒介导的RNA干扰能有效逆转MDR1基因所致耐药性：慢病毒显示出对耐药细胞高效、稳定的感染能力，有利于后续的RNA干扰实验。荧光定量PCR结果示RNA干扰后两种耐药细胞的MDRl基因水平均明显下调(K562/MDR1下调达100％，K562/A02下调达96.15％)； 流式细胞仪检测到细胞表面P-gp蛋白表达也明显下调(两种细胞均达100％)；柔红霉素泵出试验证实干扰后耐药细胞药物外排能力的明显下降；MTT试验示RNA干扰后耐药细胞耐药性明显下降。各项指标均证实慢病毒介导的RNA干扰有效逆转了MDR1基因所致耐药性。 结论: 1．采用逆转录病毒载体介导的转基因方法成功构建了MDR1基因单因素所致耐药细胞系K562/MDR1，为研究MDR1基因介导的耐药提供了更稳定，更特异的细胞模型。 2．我们构建的编码靶向MDR1基因shRNA的慢病毒载体，可有效下调MDR1基因和P-gp蛋白表达，逆转MDR1基因介导的耐药，但基因下调与蛋白下调存在时间上的不同步。 3．慢病毒介导RNA干扰，作用更为高效稳定，使长期的MDR1基因沉默成为可能。

目录

论文说明：英文缩写索引

声明

前 言

第一部分利用逆转录病毒载体构建MDR1基因单因素耐药细胞系

材料和方法

结 果

讨 论

第二部分MDR1小干扰RNA对转基因白血病耐药细胞株耐药性逆转的研究

材料和方法

结 果

讨 论

全文总结

本研究创新点

参考文献

文献综述 基因治疗中的病毒载体

致 谢