CG-6树脂吸附分离人凝血酶原复合物的研究

摘要

人凝血酶原复合物浓制剂(Prothrombin Complex Concentrate，PCC，亦称PPSB)是一种主要含有凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和X的血液制品，泛称因子Ⅸ浓制剂。PCC是乙型血友病的重要治疗替代药物，目前主要用进口DEAE SephadexA50葡聚糖类凝胶型树脂以批式吸附的方法来制备。由于凝胶型树脂机械强度差、生产过程中损失率高、间歇开放性生产操作繁琐、容易染菌及操作人员的生物安全性等限制，使得现在PCC制品生产成本高，限制了PCC制品的产量及其在临床中的应用。因此，研制开发机械强度高、吸附性能优良、成本低廉的人工合成分离介质并将其应用于连续、封闭的柱层析PCC纯化的新工艺，以提高PCC制品的产量和质量并降低生产成本，就成为十分迫切和有意义的工作。 本文以PCC纯制品为研究对象，首先对实验室制备的不同大孔阴离子树脂吸附PCC的静态吸附量和吸附速率进行考察，筛选出了吸附性能优良的CG-6树脂并对其物性和结构进行了测定。然后考察了CG-6树脂对PCC的吸附平衡，计算并分析了吸附过程中的吸附动力学和热力学行为，并研究了不同因素对固定床条件下CG-6吸附PCC的影响；最后对CG-6从血浆中分离纯化PCC进行了初步研究。研究结果如下： 通过静态吸附实验，CG-6树脂对PCC的吸附量达65．337mg/g，吸附率超过87％，远高于其它其它合成树脂；对CG-6树脂的结构和物性测定结果表明，CG-6平均粒径为165．89 μm，平均孔径为153．57 nm，为典型的大孔树脂结构。 CG-6对PCC的吸附特性研究表明，CG-6适合在磷酸盐缓冲环境中吸附PCC，缓冲液浓度、pH值和离子强度对吸附平衡有着较大的影响：pH值的升高有利于平衡吸附量的增大，而缓冲液浓度和离子强度的增大则降低了平衡吸附量；吸附平衡可以用Langmuir方程描述，吸附焓变为115.1kJ/mol、熵变AS为2.37(15℃)、20.97(20℃)、23.11(25℃)、37.32(30℃)kJ·mol<'-1>·K<'-1>，吉布斯自由能变化AG分别为-0.54(15℃)、-5.93(20℃)、-6.66(25℃)、-11.20(30℃)kJ·mol<'-1>；用拟二级方程对吸附过程进行拟和，通过计算求得吸附反应速率常数为0.00103g/mg.min； CG-6在固定床内对凝血酶原复合物(PCC)溶液的吸附穿透行为的考察结果表明：流速、进样浓度和高径比对PCC在CG-6上的吸附效率有着显著影响，在考察范围内，随着流速的下降，吸附效率从51.45％增加到73.98％，而进样浓度的降低使吸附效率从32.14％增加到61.64％；高径比的增加也会提高CG-6对PCC的吸附效率，但继续增大高径比则会降低树脂的利用率。对CG-6吸附PCC机理的初步探讨表明，CG-6树脂带有大量的离子交换基团，而吸附PCC所需的比表面积和孔结构并不占优势，因此，在CG-6吸附PCC过程中离子交换机理占有绝对的优势。通过对穿透过程中流出液pH值考察，表明CG-6在对PCC的吸附过程中孔结构和比表面积并不占优势，吸附机理以离子交换为主。 初步考察CG-6对血浆中对PCC的分离纯化效果，并对洗脱样进行了活性测定，在0.8mol/L和1.2mol/L NaCl洗脱样中PCC比活分别达到了0.383和1.08IU/mg，与原料血浆相比，PCC纯化倍数可分别达到40倍和112倍，说明CG-6对血浆中的PCC有着较好的纯化效果。 作为一种新型大孔阴离子交换树脂，CG-6具有良好的蛋白吸附性能，可以作为一种蛋白质纯化分离介质。通过对CG-6分离纯化凝血酶原复合物的研究表明，CG-6在血浆中对PCC有较好的吸附性能，分离得到的PCC比活较高，有较好的纯化效果，可以对CG-6在PCC分离纯化新工艺开发中的应用作进一步的研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章综述

1.1生物分离技术

1.1.1生物分离技术的特点

1.1.2生物分离技术过程设计的优化

1.2离子交换分离工程

1.2.1离子交换技术的定义及原理

1.2.2离子交换剂的类型

1.2.3离子交换剂与生物大分子的作用原理

1.2.4离子交换层析法在血浆蛋白分离纯化中的应用

1.3凝血酶原复合物

1.3.1凝血酶原复合物的蛋白结构和理化性质

1.3.2凝血酶原复合物(PCC)的应用现状

1.3.3凝血酶原复合物的制备

1.4研究思路及主要研究内容

第二章实验材料与方法

2.1实验药品

2.2实验设备与材料

2.3实验方法

2.3.1蛋白质浓度的测定

2.3.2树脂预处理

2.3.3蛋白质溶液的配制

2.3.4凝血酶原复合物(PCC)蛋白液效价的测定

2.3.5静态吸附方法

2.3.6固定床层析

第三章纯化人凝血酶原复合物树脂的筛选及结构物性测定

3.1引言

3.2实验方法

3.2.1纯化PCC树脂的筛选

3.2.2吸附率曲线的测定

3.2.3大孔树脂的结构及性能测定

3.3结果与讨论

3.3.1 PCC分离纯化树脂的筛选

3.3.2 CG-6树脂的结构及物性测定

3.4本章小结

第四章CG-6对凝血酶原复合物的静态吸附行为研究

4.1引言

4.2实验与分析方法

4.2.1实验方法

4.2.2分析方法

4.3实验结果

4.3.1吸附条件对吸附平衡的影响

4.3.2吸附等温线

4.3.3吸附热力学行为

4.3.4吸附动力学行为

4.4本章小结

第五章固定床内CG-6吸附凝血酶原复合物的研究

5.1引言

5.2实验与分析方法

5.2.1固定床层析

5.2.2蛋白质浓度检测

5.2.3流速对穿透曲线的影响

5.2.4进样液浓度对穿透曲线的影响

5.2.5层析柱高径比对穿透曲线的影响

5.2.6穿透行为分析方法

5.3实验结果

5.3.1流速对穿透曲线的影响

5.3.2进样浓度对穿透曲线的影响

5.3.3高径比对穿透曲线的影响

5.3.4吸附机理讨论

5.4本章小结

第六章CG-6从人血浆中分离凝血酶原复合物的初步研究

6.1引言

6.2实验材料与分析方法

6.2.1实验材料

6.2.2蛋白质含量测定

6.2.3 FIX活性检测

6.2.4冰冻血浆的解冻

6.2.5吸附及洗脱操作

6.3实验结果与讨论

6.3.1CG-6血浆吸附实验

6.3.2洗脱条件的考察

6.4本章小结

第七章结论

参考文献

研究生期间发表文章

致谢