百草枯致肺损伤中肌成纤维细胞的骨髓源性研究

摘要

背景和目的：百草枯对人畜具有高毒性，口服中毒主要吸收、聚集于肺部，引起急性肺部炎症反应，启动不可逆性的肺纤维化过程，最终导致大部分患者于数周内死亡。肌成纤维细胞具有分泌细胞因子和合成细胞外基质的双重作用，成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化及后者的持续存在是肺纤维化发生进展的关键。目前关于肌成纤维细胞的来源尚无定论，本研究探讨肌成纤维细胞是否源于骨髓，以及是否在百草枯致肺损伤中发挥作用，以期为百草枯的治疗提供新的治疗思路。 方法：以密度梯度离心法分离近交系雄性：f344大鼠外周血循环成纤维细胞，培养10～12天，检测细胞活力并用DAPI荧光染料标记。将30只SPF级近交系雄性f344大鼠随机分为百草枯中毒组和正常对照组，一次性灌胃80mg/kg百草枯或等量生理盐水制备百草枯中毒模型或正常对照组。造模后经鼠尾静脉注入DAPI标记的循环成纤维细胞，分别于细胞转输后1天、7天和14天时处死，每次5只。取肺组织固定后行HE染色观察病理变化，测量肺泡间隔面积，采用免疫组化染色检测肺组织内α-SMA和CD<,34>的表达，采用免疫荧光染色检测肺内DAPI蓝色荧光表达。 结果：①外周血循环成纤维细胞分离成功，生长良好，转输前活细胞率90％以上。②百草枯中毒组大鼠肺组织HE染色可见进行性肺损伤，肺间质充血水肿，肺泡腔内炎性渗出，成纤维细胞增生及肺泡间隔增宽，在三个时间点其肺组织肺泡间隔面积均明显增大，与正常对照组比较具有统计学差异(P=-0.000；P=-0.000；P=0.046)。③在三个时间点，百草枯中毒组α-SMA表达均高于正常对照组，具有统计学差异(P=0.012；P=-0.000；P=-0.000)；三个时间点百草枯中毒组α-SMA表达进行性增强，三组间比较有统计学差异(P=0.009)。④在各时间点，百草枯中毒组CD<,34>表达强度均高于正常对照组，但无统计学差异(P=-0.446；P=-0.326；P=0.594)；三个时间点百草枯中毒组组间比较无统计学差异(P=0.757)。⑤百草枯中毒组肺切片荧光显色可见有较明亮的蓝色荧光，早期多聚集于血管周围，后期可见肺间质内表达；正常对照组蓝色荧光微弱或不可见。 结论：采用80mg/kg中毒量灌胃制备百草枯中毒致肺损伤模型成功，给药方式和剂量选择合适。随时间不同百草枯中毒大鼠肺组织切片显示为肺泡炎和纤维化改变。应用密度梯度离心法成功从外周血中分离出成纤维细胞，所得循环成纤维细胞能够进行体外培养，并用于体内细胞转输实验。：DAPI可有效标记细胞，易于操作，标记率高。采用DAPI标记的循环成纤维细胞转输入百草枯中毒大鼠体内两周内，即使细胞分裂仍可检测到蓝色荧光，显示存在输入的循环成纤维细胞。转输循环成纤维细胞后，百草枯中毒大鼠肺组织免疫组化染色显示α-SMA表达明显升高，表明肺组织内有肌成纤维细胞出现。冰冻切片亦检测到DAPI蓝色荧光的表达，提示循环成纤维细胞参与了肺损伤后的修复过程。

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综述：肺纤维化与肌成纤维细胞

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