流体剪应力对去卵巢骨质疏松大鼠破骨细胞骨吸收功能的影响

摘要

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是中老年人的一种常见病，是以骨量减少、骨组织微观结构退化为特征，致使骨的脆性增高而骨折危险性增加的一种全身性疾病。一般情况下，3位女性有1人易患骨质疏松症，而男性一般是12人中有1人患骨质疏松症。可见，骨质疏松症是发病率、死亡率和医疗保健消耗较大的疾病。因此，骨质疏松症的预防和治疗是很重要的。影响骨质疏松症发生发展的因素有很多，力学负荷是其重要因素之一。体外研究已证实，力学负荷在正常骨组织的发育过程中具有重要的作用。骨组织中的腔隙结构构成纵横交错的三维网络，这些腔隙中充满了组织液。正常活动对骨组织施加的机械负荷，将引起这些腔隙体积的变化，从而形成液压促进流动，因此认为在骨组织内，这种液体的流动产生的剪应力可能在骨的生长发育过程中发挥了重要作用。然而，破骨细胞对剪应力是否敏感，破骨细胞是如何将力学刺激信号转换成生物化学信号，在骨质疏松中破骨细胞对力学刺激的敏感性是否有变化，目前仍不清楚。因此，我们假设，破骨细胞和前提破骨细胞是剪应力敏感细胞，破骨细胞表面integrinα<,v>β<,3>参与破骨细胞中力学信号转导。本研究的目的就是：1)探讨剪应力对正常和去卵巢骨质疏松大鼠破骨细胞骨吸收功能活性的影响；2)探讨破骨细胞integrinα<,v>β<,3>在力学信号传导中可能的分子机理。 1.骨质疏松动物模型的建立选用健康6月龄雌性未生育Sprague-Dawley(SD)大鼠，采用双侧卵巢切除术，建立模拟人绝经后骨质疏松动物模型。动物实验分为2组：对照组(control)，不切除卵巢、卵巢切除组(ovx)，切除双侧卵巢。手术后3个月处死动物，检测动物体重、子宫重量；做骨组织病理学切片，观察骨组织形态学和骨细胞功能活性的变化，以确定模型建立成功。 2.破骨细胞体外培养无菌分离大鼠腰椎(L<,1-5>)，采用机械分离法和1，25-(OH)<,2>VitD<,3>全骨髓诱导法相结合，从大鼠椎骨骨髓细胞中获取破骨细胞，以细胞形态、TRAP染色阳性、骨吸收陷窝的形成、细胞骨架等指标观察、鉴定破骨细胞。 3.羟基磷灰石涂层盖玻片的制备由于对骨片的加力装置设计较难，考虑人体内骨组织无机成分主要是羟基磷灰石。因此，我们采用羟基磷灰石涂层血盖片的方法来模拟体内骨基质吸收情况。以Ca(NO<,3>)<,2>·4H<,2>O和P<,2>O<,6>为原材料，采用溶胶一凝胶法制备羟基磷灰石涂层盖玻片，模拟破骨细胞在骨片上的骨吸收情况。 4.剪应力对破骨细胞功能活性影响的检测 1)采用本室自制的流体剪应力加载系统对所选用的破骨细胞分别施加0、5.97、11.36、16.08、20.54dyne/cm<'3>的剪应力，作用30min；每次剪应力作用结束后，收集灌流液10ml冻存，备用。用紫外分光光度仪检测TRAP活性；采用羟基磷灰石涂层盖玻片模拟体内骨基质吸收情况，以扫描电子显微镜和图像分析软件检测骨吸收陷窝数量和面积，观察不同剪应力强度对正常和骨质疏松大鼠破骨细胞功能活性的影响； 2)再根据以上实验结果，选取对破骨细胞功能活性影响最大的剪应力强度，观察剪应力作用不同时间，正常和骨质疏松大鼠破骨细胞骨吸收功能活性的变化； 5.剪应力对破骨细胞表面用integrinα<,v>β<,3>表达影响的检测采用细胞免疫组织化学技术检测剪应力作用对破骨细胞表面integrinα<,v>β<,3>表达的影响6.破骨细胞表面integrinα<,v>β<,3>表达量与破骨细胞骨吸收功能关系分析用integrinα<,v>β<,3>单克隆抗体(sc-7312)孵育破骨细胞30min，阻断破骨细胞表面integrinα<,v>β<,3>的表达，对破骨细胞作用相同的剪应力，同样用扫描电子显微镜技术和图像分析软件分析破骨细胞骨吸收功能的变化。 结果: 1.去卵巢手术后3个月，OVX组大鼠体重明显增加(p<0.01)；子宫明显萎缩，重量降低(p<0.01)；骨组织病理学切片显示骨小梁分离、断裂，数量减少，骨髓腔内含有大量脂肪细胞，骨胶原中有大量新生胶原纤维形成，破骨细胞骨吸收残迹明显增加，符合骨质疏松的特点。 2.以机械分离法和1，25-(OH)<,2>VitD<,3>全骨髓诱导法相结合从大鼠椎骨骨髓细胞中获取破骨细胞，在诱导培养第7天，所获破骨细胞数量最多，TRAP活性最佳。且在培养第1天骨质疏松组大鼠破骨细胞数和TRAP活性高于正常大鼠组。 3.羟基磷灰石(HA)涂层盖玻片可模拟骨基质吸收情况，破骨细胞在姒盖玻片上培养可以形成骨吸收陷窝。 4.在我们所选用的剪应力范围内，作用破骨细胞30min后，正常大鼠和骨质疏松大鼠破骨细胞TRAP活性、骨吸收陷窝数量和面积均较静态时增高(p<0.01)，以16.08dyne/cm<,2>的剪应力作用最明显；但骨质疏松大鼠破骨细胞功能活性的增高低于正常大鼠破骨细胞(p<0.05)。 5.16.08dyne/cm<'2>的剪应力作用破骨细胞不同时段，随着作用时间延长，破骨细胞骨吸收陷窝数量和面积逐渐增加，至60min达峰值，之后骨吸收陷窝数量和面积无明显增长趋势。 6.破骨细胞表面integrinα<,v>β<,3>表达随剪应力作用时间延长而增强，至作用60min，达峰值，之后呈下降趋势。 7．阻断破骨细胞表面integrinα<,v>β<,3>后，作用相同剪应力破骨细胞骨吸收陷窝数量和面积的增长明显低于integrinα<,v>β<,3>阻断前(p<0.05)。 结论: 1．健康6月龄雌性未生育SD大鼠去卵巢手术后3个月，可建立去卵巢后大鼠骨质疏松动物模型。 2．以机械分离法和1，25-(OH)<,2>VitD<,3>全骨髓诱导法相结合，培养的破骨细胞在第7天最多，TRAP活性最强。 3．羟基磷灰石涂层盖玻片，可模拟体内骨基质吸收情况；可代替骨片检测破骨细胞骨吸收功能。为体外破骨细胞骨吸收功能的检测提供了一种新的研究手段。 4．一定强度剪应力作用，可促进破骨细胞骨吸收功能活性。一定时段剪应力作用可上调破骨细胞表面integrinα<,v>β<,3>的表达，促进破骨细胞骨吸收活性增强，且这种变化具有时间依赖性。 5．阻断破骨细胞表面integrinα<,v>β<,3>后，剪应力促进破骨细胞骨吸收活性的作用明显降低，表明integrinα<,v>β<,3>参与破骨细胞的力学信号转导，且与破骨细胞骨吸收功能密切相关。 6．骨质疏松大鼠破骨细胞对剪应力作用的敏感性明显低于正常大鼠破骨细胞。

目录

论文说明：英文缩略表

声明

摘要

前 言

第一部分去卵巢骨质疏松大鼠和正常大鼠破骨细胞的体外培养

1引言

2材料与方法

3结果

4讨论

5结论

参考文献

第二部分流体剪应力对去卵巢骨质疏松大鼠和正常大鼠破骨细胞骨吸收功能的影响

1引言

2材料与方法

3结果

4讨论

5结论

参考文献

第三部分流体剪应力对去卵巢骨质疏松大鼠和正常大鼠破骨细胞表面integrinαvβ3表达的影响

1引言

2材料与方法

3结果

4讨论

5结论

参考文献

全文总结

综 述：破骨细胞体外培养技术及其鉴定

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致 谢