抗AFP重链可变区单域抗体融合蛋白的构建、表达及初步鉴定

摘要

[目的]: 构建抗甲胎蛋白(AFP)重链可变区(VH)单域抗体融合蛋白基因，并在大肠杆菌中表达，分离并初步纯化抗AFP TrxA-V<,H>单域抗体融合蛋白，并鉴定其生物学活性。 [方法]: 采用已构建的抗AFP单链抗体(ScFv)的载体为模板,经PCR扩增出抗AFP V<,H>单域抗体基因，将其克隆到pGEM-T载体，构建重组pGEM-V<,H>载体，转化大肠杆菌DH5 α并鉴定。用限制性内切酶同时双酶切重组pGEM-V<,H>载体和大肠杆菌TrxA融合蛋白表达载体pET32a(+)，将从pGEM-V<,H>载体上酶切获得的VH基因连接到pET32a(+)质粒中，构建重组pET32a-V<,H>质粒，转化大肠杆菌BL-21(DE3)。通过限制性内切酶酶切、PCR和测序鉴定，将鉴定正确的阳性克隆通过IPTG诱导表达，SDS-PAGE及Western-blot鉴定表达产物。将阳性克隆大量发酵培养，溶解细菌，分离纯化包涵体，用高浓度尿素将包涵体变性溶解，再通过梯度浓度透析复性，获得较高纯度的TrxA-V<,H>单域抗体融合蛋白。通过与其亲本单克隆抗体进行竞争抑制ELISA来分析TrxA-V<,H>融合蛋白的抗原结合活性；肝癌细胞株HepG2细胞免疫组化染色分析其结合及内化情况；取原发性肝癌病理切片做免疫组化，并做正常肝组织对照。 [结果]: (1)成功克隆出抗AFP V<,H>单域抗体基因，酶切、PCR及测序鉴定证实，V<,H>单域抗体基因全长339bp，正确克隆至pGEM-T载体。将正确构建的重组pET32a-V<,H>质粒，转化大肠杆菌BL-21(DE3)，经过IPTG诱导后获得高效表达。目的蛋白以包涵体形式存在，经反复洗涤、变性及复性后，可获得获得较高纯度的抗AFP的TrxA-V<,H>单域抗体融合蛋白。SDS-PAGE及Western-blot证实在相应分子质量处，有TrxA-V<,H>融合蛋白的特异性显色条带，其分子量约为33KD。 (2)竞争抑制ELISA结果显示该融合蛋白具有良好的抗原结合能力。 (3)肝癌细胞株HepG2免疫组化结果显示该融合蛋白与天然AFP具有良好的结合能力及内化能力。原发性肝癌病理切片免疫组化结果显示该融合蛋白可用于原发性肝癌的病理辅助诊断中。 [结论]: 目前AFP是原发性肝癌诊断和生物治疗的一种重要的靶抗原。我们构建的抗AFP TrxA-V<,H>单域抗体融合蛋白分子量小，经过竞争抑制ELISA、免疫细胞化学及原发性肝癌病理组织免疫组化证实具有良好的抗原结合能力及内化能力，且因为是融合蛋白，结构较单链抗体稳定，因此该单域抗体融合蛋白可能在原发性肝癌的放免显像和靶向治疗中具有应用前景。

目录

声明

前 言

第一部分抗AFP重链可变区单域抗体融合蛋白基因的构建、表达

材料与方法

实验结果

讨论

附图

第二部分抗AFP重链可变区单域抗体融合蛋白的初步鉴定

材料与方法

实验结果

讨论

全文总结

参考文献

文献综述：单域抗体

致谢