胚胎干细胞体外分化成造血前体细胞和骨骼肌细胞的研究

摘要

第一部分:胚胎于细胞体外分化成造血前体细胞的研究;目的:用小鼠ES细胞作为研究材料,在体外培养条件下加入外源细胞因子的不同组合,启动ES细胞向CD34<'+>造血前体细胞分化,为寻找影响成血发育早期阶段的细胞因子和培养条件提供实验资料.方法:我们选用甲基纤维素半固体培养系统,采用EBs分化诱导法,加入不同的外源的细胞因子的组合,启动小鼠ES细胞向造血细胞分化.以CD34<'+>细胞作为造血前体细胞的标志,用流式细胞计术检测了一组造血细胞因子BMP4、bFGF、SCF、Tpo、VEGF等的不同组合生成CD34<'+>细胞的比例,分析这些细胞因子在成血发育早期阶段的作用.结论:在ES细胞体外分化成CD34<'+>造血前体细胞过程中,细胞因子BMP4和/或bFGF作用于ES细胞成血分化的最早期阶段,是早期作用因子.相比较而言,VEGF作用于ES细胞成血分化的较后期阶段,是一个后期作用因子.第一、二阶段加入BMP4、VEGF的顺序组合与第二阶段加入Tpo、VEGF组合均能较有效的诱导ES细胞生成CD34<'+>造血前体细胞.第二部分:胚胎干细胞体外分化成的造血前体细胞移植入小鼠体内的研究;目的:用8组不同组合的外源细胞因子将ES细胞在体外进行成血分化诱导并移植入小鼠体内,观察哪组细胞因子组合能有效诱导ES细胞生成有长期造血功能的造血前体细胞.为探索ES细胞来源的造血干细胞移植应用于临床提供实验资料.方法:采用第一部分的ES细胞体外分化体系.采用甲基纤维素半固体培养系统和EBs分化诱导法,在培养体系中加入8组不同组合的外源的细胞因子,将ES细胞在体外诱导分化成造血前体细胞,并将这8组分化细胞分别移植入辐射照射的BALB/c小鼠体内去观察其功能.在细胞移植后10天取8组移植细胞的受体小鼠的各种器官,冰冻切片,X-gal染色观察来源于ES细胞的移植细胞是否归巢及是否存在组织非特异性分布现象.结论:细胞因子BMP4、VEGF的顺序组合能诱导ES细胞生成有长期造血能力的造血前体细胞,移植后能长期植入受体小鼠体内,形成低程度的嵌合状态.第三部分:体外诱导胚胎干细胞分化为骨骼肌细胞的研究;目的:用RA作为诱导剂将ES细胞在体外诱导分化成骨骼肌细胞,为深入探讨骨骼肌细胞的发育提供实验资料.方法:选用液体培养系统,先让ES细胞不贴壁悬浮生长形成EBs,再将生长5天的EB种入细胞培养皿中使其贴壁生长.结论:通过给予ES细胞适当的培养条件,5×10<'-7>M浓度的RA作为诱导剂能有效地将ES细胞诱导分化成骨骼肌细胞.第四部分:胚胎干细胞来源的骨骼肌细胞横向分化成血细胞的研究;目的:将ES细胞体外分化成的骨骼肌细胞移植入辐射照射后的小鼠体内,观察ES细胞来源的骨骼肌细胞是否能横向分化成血细胞.方法:将ES细胞体外分化成的骨骼肌细胞分别移植入BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠这两种MHC I型不同的辐射照射后的受体小鼠体内,对两种受体小鼠进行长期存活观察.取长期存活的BALB/c受体小鼠,通过PCR检测其外周血中是否有移植细胞携带的Lac-Z报告基因,流式细胞仪检测其胸腺、脾脏、骨髓、外周血中ES细胞来源的细胞所占的比例来确定ES细胞来源的骨骼肌细胞在移植入辐射照射小鼠体内后能否横向分化成血细胞.结论:ES细胞来源的骨骼肌细胞移植入辐射照射小鼠体内后能横向分化成血细胞,与受体小鼠自身的血细胞形成低程度的嵌合状态.