BPOZ基因剔除小鼠模型的建立及BPOZ基因功能的研究

摘要

BPOZ(Bood POZ containing gene)又名EFlABP(elongation factor 1A bindingprotein),基因位于染色体的3q21.3,其序列在不同种属间相当保守.BPOZ蛋白由ANK(ankyrin repeat,锚蛋白重复)和BTB(Broad-Complex,Tramtrack andBric a brac)结构域组成.ANK和BTB结构域介导蛋白相互作用,含这两个结构域的蛋白常与发育及肿瘤发生密切相关,提示BPOZ可能有重要的生物学功能.BPOZ在卵巢癌组织中的表达降低,抑癌基因PTEN可诱导BPOZ表达升高.BPOZ能抑制肿瘤细胞生长,转染并稳定表达BPOZ的结肠癌细胞生长变慢,细胞周期的S期延长并有明显的G1/S转变延缓.因此BPOZ可能是一个参与PTEN信号传导通路的细胞生长或肿瘤抑制基因.基因剔除(gene knockout)是在小鼠整体水平研究基因在生物体内(in vivo)功能的一种直接有效的方法.我们拟通过基因剔除技术建立BPOZ基因缺失小鼠,通过对BPOZ基因剔除小鼠的表型分析来研究BPOZ基因缺失对小鼠生长发育和生理功能等方面的影响,以及BPOZ与肿瘤发生的关系.为探讨BPOZ基因剔除对细胞生长的影响,我们采用细胞生长曲线、<'3>H胸苷掺入、裸鼠荷瘤、细胞周期分析等一系列实验来评价BPOZ-/-ES细胞的增殖能力.实验结果均证明BPOZ-/-ES细胞的生长变慢,细胞周期分析发现有G1/S期阻滞.进一步的实验发现BPOZ-/-MEF细胞也明显生长减慢.BPOZ-/-细胞生长变慢的结果说明BPOZ可能是细胞正常生长过程中的必要组分.BPOZ可能在调节细胞生长上起双重作用:即一定水平的BPOZ维持细胞的正常生长,但在高表达时抑制细胞的生长.为阐明BPOZ是否介导特异靶蛋白的降解及其作用机理,我们研究了BPOZ和EF1A(elongation factor 1A)相互结合的结构域以及BPOZ不同结构域和介导EF1A降解的关系.首先我们用蛋白体外结合实验证实BPOZ能与EF1A结合,激光扫描共聚焦显微镜观察发现BPOZ蛋白与EF1A1、EF1A2蛋白在细胞内共定位,说明在体内和体外BPOZ均能与EF1A相互结合.体外结合实验发现截去N端ANK结构域的BPOZ与EF1A不再相互结合,但截去C端BTB结构域的BPOZ仍能与EF1A结合,说明BPOZ通过ANK结构域与EF1A结合.截短的BPOZ与EF1A在细胞内的共定位实验进一步在细胞的水平验证了体外结合实验的结果.

目录

缩略词

第一部分BPOZ基因剔除小鼠的产生及表型分析

实验一、BPOZ基因剔除小鼠的产生

实验二、BPOZ基因剔除小鼠表型分析

第二部分BPOZ对细胞生长的影响

第三部分BPOZ与EF1A蛋白相互作用的研究

结论

参考文献

综述ef1x：一个功能广泛的蛋白延长因子

致谢

博士研究生期间发表和待发表的文章